一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统技术方案

本发明专利技术公开了一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器。本发明专利技术利用时域聚焦特性，只在时域聚焦平面产生样品的荧光激发，并同时实现对整个时域聚焦平面内荧光的激发。因此，本发明专利技术与原有技术相比，能够避免对非聚焦平面内样品的漂白，并能够有效提高SMS荧光显微技术的工作效率。

【技术实现步骤摘要】
一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统
本专利技术涉及光学仪器领域、生物医学显微成像领域，具体涉及一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统及方法。
技术介绍
目前在生物医药领域的研究对显微系统分辨率的要求越来越高，研究人员需要了解各种微小形态物质的三维结构，然而传统白光宽场显微镜和激光共聚焦显微镜的光斑尺寸无法达到这样的分辨率，而超分辨显微系统的出现完美地解决了这个问题。在超分辨显微技术中，目前的研究热点大多集中于各类荧光显微技术方面，诸如受激发射损耗(STED)荧光显微技术和单分子定位荧光显微技术(SMS)等。与STED荧光显微技术相比，SMS荧光显微技术的光路设计、机械结构都较为简单，无需多光束的合束，因此实际使用较广泛。SMS荧光显微技术的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上万次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。E.Betzig等人在期刊Science第313期的文章ImagingIntracellularFluorescentProteinsatNanometerResolution中提到采用宽场照明和连续激光作为光源简化SMS荧光显微系统的结构。但是，如果要对样品实现大深度的三维成像(成像范围在深度方向上大于1μm)时，需要结合微位移台改变样品的高度来实现。在这种工作模式下，由于在整个成像过程中，整个样品，包括处在非观测平面的区域内的荧光蛋白都会被激发。非观测平面荧光蛋白被长期激发，会导致荧光蛋白失去活性，被漂白。当微位移平台继续移动，使原来的非观测观测区域成为成像平面后，由于之前荧光蛋白已经被漂白，该成像平面将无法实现荧光蛋白再激发、成像的过程。该问题在利用SMS荧光显微技术进行深层组织成像时尤为明显。因此，现有的三维SMS并不能很好的满足实际的需求。
技术实现思路
本专利技术针对之前三维SMS荧光显微技术在进行深度方向扫描时，存在的荧光蛋白分子被漂白等问题，提出了一种新型的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统。该系统利用时域聚焦特性，不漂白非聚焦平面的荧光蛋白分子，结构简单，并且通用性好、也可用于二维成像。一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器并经第二二色镜透射的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；所述样品台移动时，物镜出射的激光的时域聚焦平面处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像。本专利技术的探测器得到的多个荧光图像，一般需要信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。所述信号处理单元可以是为本专利技术三维超分辨显微系统专配的单一拼接图像处理器也可以直接采用现有的工业计算机。当然，为便于研究和分析，本专利技术的三维超分辨显微系统还可以包括具有图像显示功能、或者/和参数设置或者/和命令输入等功能的显示器，可以是为本专利技术三维超分辨显微系统专配的显示器，也可以直接采用现有的工业计算机配套的显示器等。所述拼接操作为现有技术，可通过现有的软件或者编程实现。作为优选，所述扩束准直单元包括同轴设置的第一透镜和第二透镜，第一透镜和第二透镜共焦放置，第一透镜靠近第一激光器设置，且第一透镜焦距小于第二透镜。本专利技术中，所述第一透镜和第二透镜用于将激光光束扩束准直，使得激光光束直径变大，发散角变小，更接近于平行光，有利于激光光束会聚形成更小的光斑；第一透镜和第二透镜一般选择凸透镜。本专利技术中，所述的时域聚焦，是指单个飞秒脉冲的所有频率仅在物镜的聚焦平面上重和，并且彼此同相位，从而使脉冲在时域上的宽度极窄的聚焦效应；即时域聚焦时，将聚焦于整个聚焦平面，并且焦深极小，只激发样品位于时域聚焦平面内极薄层的荧光。本专利技术的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统的一次工作循环包含以下步骤：步骤A：所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器的激光合束，经过第三透镜、第一二色镜后进入物镜，宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；步骤B：所述第一激光器出射的激光经过第一透镜、第二透镜后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射；经过相位光栅反射后的激光经过第二二色镜、第三透镜和第一二色镜后，被聚焦到物镜的后焦平面处；第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；结合样品台的相对物镜移动，物镜出射的激光的时域聚焦平面可处于样品的不同深度，激发样品不同深度处的荧光，实现对步骤A中样品中被激活的荧光标记的逐层扫描；样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，之后被第一二色镜反射；被反射的荧光依次通过滤光片、第四透镜，被探测器接收并成像；步骤C：所述第二激光器出射的激光持续照射样品，直到将步骤A中激活的样品内部分的荧光标记漂白为止；重复步骤A、B、C的工作循环，直到样品中所有的分子被定位成像；最后经过信号处理单元对探测器接收的每个时域聚焦平面的荧光信号进行拼接，获得整个样品的三维超分辨结构。通过控制第二激光器的出射光强(小于1毫瓦)，控制被重新激活的荧光标记的比例(<<1％)。作为优选，本专利技术中，所述第一激光器为飞秒激光器，出射的激光强度大，脉冲宽度为飞秒量级，出射激光的光谱带宽为10纳米。作为进一步优选，所述第一激光器为钛蓝宝石飞秒激光器，最终输出峰值波长为830纳米，光谱带宽为10纳米，脉冲宽度小于100飞秒，输出平均功率为1.5瓦。采用该技术方案，可以在保证双光子激发效率的同时，减少对于非成像平面荧光标记的漂白，改善系统在整个三维成像区域的成像质量。作为优选，本专利技术中，所述的第二激光器为连续光激光器。作为进一步优选，所述第二激光器为连续光半导体激光器，输出波长为405纳米。本专利技术中，所述相位光栅用于调节第一激光器出射激光的相位，使得激光光束中不同波长的光同级衍射的衍射角度不一致，即激光发生色散，激光光束中不同波长的激光在相位光栅表面反射角度不同，但同波长的激光光束仍本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，其特征在于，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器、并经第二二色镜透射的激光合束，再经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，最后宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像。

【技术特征摘要】
1.一种抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，其特征在于，包括第一激光器、扩束准直单元、相位光栅、第三透镜、第一二色镜、物镜、可正对物镜往复移动的样品台、滤光片、第四透镜、探测器、第二二色镜、第二激光器；所述第一激光器出射的激光经过扩束准直单元扩束准直后，倾斜入射到相位光栅表面，并被相位光栅反射后照射至第二二色镜；所述第二激光器出射的激光被第二二色镜反射后，与来自第一激光器、并经第二二色镜透射的激光合束，再经过第三透镜、第一二色镜后被聚焦在物镜的后焦平面处，最后宽场照明样品台上的整个样品，激活样品内部分的荧光标记；所述第一激光器出射的激光从物镜出射后将在物镜的焦平面处产生时域聚焦，激发样品台上处于时域聚焦平面的已被第二激光器激活的样品的荧光；所述样品中被激发的荧光沿激光传播相反的方向传输，重新进入物镜，然后被第一二色镜反射后，再依次通过滤光片、第四透镜，最后被探测器接收并成像。2.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，其特征在于，所述扩束准直单元包括同轴设置的第一透镜和第二透镜，第一透镜和第二透镜共焦放置，第一透镜靠近第一激光器设置，且第一透镜焦距小于第二透镜。3.根据权利要求1所述的抗漂白单分子定位三维超分辨显微系统，其特征在于，所述第一激光器...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旸晖，周辉，李雨雪，刘小煜，夏成樑，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33