一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法。本方法运用DTNB能够与巯基相互作用形成有色的硫酚阴离子的反应机理，通过检测反应产物中巯基的生成量来测定蛋白样品的苯甲醇乙酰转移酶活性。本方法的优点是：实验操作步骤简单、样品用量较少以及检测结果灵敏准确。应用本方法可以较简易地从不同蛋白样品中筛选高效的苯甲醇乙酰转移酶。

【技术实现步骤摘要】
一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法
本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种在体外酶反应体系中检测待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶活性的方法。
技术介绍
乙酸苯甲酯存在于许多植物的花和果实中，其生物合成途径是以苯甲醇和乙酰辅酶A为底物，在苯甲醇乙酰转移酶的作用下生成乙酸苯甲酯。现有技术中没有较成熟的检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，研究中一般是结合质谱技术对反应产物进行定性和定量，进而换算得到酶活性相关参数。然而，此方法操作步骤较繁琐，实验周期较长，成本较高，不利于生物合成途径中苯甲醇乙酰转移酶的开发和研究。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的新方法。所述方法有利于从生物中寻找高效的苯甲醇乙酰转移酶，并建立酶制备工艺和酶工程体系。本专利技术所采用的技术方案如下：一种检测待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，包括：将待测蛋白样品、DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl2加入水中混匀进行酶活反应，检测反应体系的吸光度，计算出巯基的生成量，进而计算出待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的活性。所述待测蛋白样品、DTNB、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl2的质量比为(100-5000)：(1480-5950)：(1510-12150)：(400-1630)：(3-15)；优选为(100-5000)：(1486.32-5945.26)：(1517.95-12143.56)：(405.49-1621.96)：(3.57-14.28)；进一步优选为1000：(2970-2980)：(3030-3050)：(800-820)：(7-8)；更进一步优选1000：2972.63：3035.89：810.98：7.14。所述待测蛋白样品为组织粗提取蛋白或纯化蛋白，如梅花花瓣粗提取蛋白、烟草叶片粗提取蛋白。所述MgCl2的适量添加可有效维持酶活性。所述酶活反应是在20-35℃水浴条件下进行，优选为30℃。所述检测反应体系的吸光度是以反应开始为起点，每隔10-30min检测一次，如0、30、60、90、120min，直至反应结束。所述吸光度的检测波长为412nm波长。所述巯基的生成量的计算公式如下：巯基含量(μmol/mg)＝73.53×(An-A0)/C其中，An为不同时间点反应体系在412nm波长的吸光度；A0为反应初始时间点0min，反应体系在412nm波长的吸光度；C-蛋白样品量(mg)；n为检测时间。所述空白对照组是将实验组中待测蛋白样品替换为待测蛋白样品煮沸、离心后取得的上清液。所述苯甲醇乙酰转移酶的活性的计算如下：以时间为横坐标(min)，巯基含量为纵坐标(μmol/mg)，建立巯基含量随时间的变化曲线；所述变化曲线先呈线性升高，而后保持水平变化趋势。根据线性区段的变化曲线计算线性区段的斜率，即为待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的酶活性值(μmol/mg/min)。需要注意的是，当曲线中多个区域呈线性(如0-30min范围间、60-90min范围间均呈线性)时，取靠前的时间段(0-30min)，以尽可能保证检测的准确性。与现有的运用质谱技术检测酶活性的方法相比，本专利技术的有益效果是：实验操作步骤简单，省去了从反应体系中萃取反应产物的步骤，而直接通过DTNB的显色反应(利用DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))与乙酰辅酶A脱去酰基后暴露的巯基相互作用，形成有色硫酚阴离子的机理)，在分光光度计下检测硫酚阴离子的吸光度，计算出巯基的生成量，进而计算出蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的活性；样品用量较少，可以在2mL塑料离心管里完成酶催化反应；检测结果灵敏准确，DTNB显色反应灵敏，并且免去了萃取步骤，可以消除萃取剂选择对测试反应的结果的影响。附图说明图1为梅花花瓣样品苯甲醇乙酰转移酶活性变化曲线；图2为烟草叶片样品苯甲醇乙酰转移酶活性变化曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1梅花花瓣粗提取蛋白中苯甲醇乙酰转移酶活性分析本实施例提供一种梅花花瓣粗提取蛋白中苯甲醇乙酰转移酶活性的检测方法，包括：1、实验试剂母液配置：(1)10mMDTNB母液的配制：称取0.2gDTNB粉末溶于50mL0.5MTris-HCl(pH8.0)，避光储存，现用现配；(2)50mM乙酰辅酶A母液的配制：50mg乙酰辅酶A粉末加入1.2mL水，混匀至完成溶解，-20℃储存；(3)1M苯甲醇母液的配制：100μL苯甲醇(分析纯)加入864μLDMSO，混匀，-20℃储存；(4)1mMMgCl2母液的配制：1MMgCl2母液稀释1000倍获得。其中1MMgCl2母液配置：称取9.521gMgCl2粉末，加入100mL水，混匀，4℃储存。2、蛋白苯甲醇乙酰转移酶活性检测体系配置：(1)实验组：2mL塑料离心管中加入DTNB母液150μL、乙酰辅酶A母液15μL、苯甲醇母液1.5μL、MgCl2母液15μL和梅花花瓣粗提取蛋白样品200μg，用水补齐体积至1.5mL，混匀。实验组样品做三个重复。(2)对照组：将梅花花瓣粗提取蛋白样品200μg在沸水中煮10min，12000rpm离心1min，取上清；其它组分的用量同实验组，混匀，配制对照组。对照组样品做三个重复。3、将实验组和对照组样品置于30℃水浴锅中进行酶活反应，于0、30、60、90、120min检测样品在412nm波长的吸光值。检测结果如表1。对照组为测吸光值的Blank。表1实验组在不同时间点的吸光值4、巯基含量计算：根据计算公式：巯基含量(μmol/mg)＝73.53×(An-A0)/C，计算组1的巯基含量：0min：巯基含量1(μmol/mg)＝73.53×(0.037-0.037)/0.2＝0；30min：巯基含量1(μmol/mg)＝73.53×(0.444-0.037)/0.2＝149.5725；60min：巯基含量1(μmol/mg)＝73.53×(0.731-0.037)/0.2＝255.045；90min：巯基含量1(μmol/mg)＝73.53×(0.877-0.037)/0.2＝308.7；120min：巯基含量1(μmol/mg)＝73.53×(0.879-0.037)/0.2＝309.435；样品重复组2和3的计算方法同上。计算巯基含量见表2。表2巯基含量(μmol/mg)5、以时间为横坐标(min)，巯基含量为纵坐标(μmol/mg)作出酶反应体系中巯基的含量随着时间的变化曲线，见图1。取线性变换区段0-30min的数值计算样品苯甲醇乙酰转移酶的活性：梅花样品酶活＝155.9425(μmol/mg)/30(min)＝5.78(μmol/mg/min)实施例2烟草叶片粗提取蛋白苯甲醇乙酰转移酶活性分析本实施例提供一种烟草叶片粗提取蛋白苯甲醇乙酰转移酶活性的检测，包括：1、实验试剂母液配置(同实施例1)2、蛋白苯甲醇乙酰转移酶活性检测体系配置：(1)实验组：2mL塑料离心管中加入DTNB母液15μL、乙酰辅酶A母液15μL、苯甲醇母液1.5μL、MgCl2母液15μL和烟草叶片粗提取蛋白样品200μg，用水补齐体积至1.5mL，混匀。实验组样品做三个重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，其特征在于，包括：将待测蛋白样品、DTNB、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl2加入水中进行酶活反应，检测反应体系的吸光度，计算出巯基的生成量，进而计算出待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种检测苯甲醇乙酰转移酶活性的方法，其特征在于，包括：将待测蛋白样品、DTNB、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl2加入水中进行酶活反应，检测反应体系的吸光度，计算出巯基的生成量，进而计算出待测蛋白样品中苯甲醇乙酰转移酶的活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测蛋白样品、DTNB、乙酰辅酶A、苯甲醇、MgCl2的质量比为(100-5000)：(1480-5950)：(1510-12150)：(400-1630)：(3-15)；优选为(100-5000)：(1486.32-5945.26)：(1517.95-12143.56)：(405.49-1621.96)：(3.57-14.28)；进一步优选为1000：(2970-2980)：(3030-3050)：(800-820)：(7-8)；更进一步优选1000：2972.63：3035.89：810.98：7.14。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测蛋白样品为组织粗提取蛋白或纯化蛋白。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述酶活反应是在20-35℃水浴条件下进行。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：包菲，张启翔，程堂仁，王佳，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11