一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法及试剂盒，属于溶藻弧菌菌种鉴定技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为溶藻弧菌。本发明专利技术所述的方法能够快速准确的鉴定溶藻弧菌，具有效率高，成本低廉，省事省力的特点，准确率达到100％，适于大量溶藻弧菌的初步筛选和鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法及试剂盒
本专利技术属于溶藻弧菌菌种鉴定
，具体涉及一种用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法及试剂盒。
技术介绍
溶藻弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，隶属于弧菌科、弧菌属，是一种常见的海洋致病菌，其数量居海水类弧菌之首。可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病。同时，它也是鱼、虾、贝等海洋水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发。由于溶藻弧菌的生理生化特征和遗传特征的复杂多样，对其进行准确鉴定比较困难，而且用传统的生理生化方法进行鉴定需要多个步骤和较长的时间：首先掌握菌株的基本特征，营养类型、需氧型等生理生化特征；在此基础上查阅分类手册，确定菌株属于哪一大类(群、组)，进行特征确定。根据测定结果逐步缩小的归属范围，初步确定科、属。如菌株需鉴定至种，则进一步测定种的鉴别特征。如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因型在内的全面鉴定。随着分类学的发展，微生物分类越来越多的以核酸序列系统发育分析来建立新的分类单元和对原有分类单元进行调整。产生新的问题：将有越来越来越多的分类单元不能只以表型特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能鉴定。现在常用的溶藻弧菌的快速检测方法主要有分子生物学方法和免疫诊断技术；而上述方法存在操作复杂，成本高、准确率低等缺点。因此，简单、快速、准确、经济的溶藻弧菌的鉴定方法，对养殖动物病害进行监测和预防就显得尤其重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法及试剂盒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法，包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为溶藻弧菌。优选的，步骤2)中所述烈性溶藻弧菌噬菌体为含有10种以上烈性溶藻弧菌噬菌体的混合液。优选的，步骤1)所述待检菌种的浓度为107～109cfu/mL，涂布体积为100～200μl。优选的，步骤2)中所述的烈性溶藻弧菌噬菌体的效价为108～1010pfu/mL，滴加体积为20～50μl。优选的，所述溶藻弧菌噬菌体的获取方法包括以下步骤：S1、将分离到的溶藻弧菌噬菌体与宿主菌溶藻弧菌混合培养，获得培养液；S2、将所述培养液固液分离，收集液相组分为溶藻弧菌噬菌体。进一步优选的，所述固液分离的方法为离心。更进一步的，所述离心的转速为1000～12000rpm，所述离心的时间为5～20min。本专利技术还提供了一种快速鉴定溶藻弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括烈性溶藻弧菌噬菌体。优选的，所述烈性溶藻弧菌噬菌体的效价为108～1010pfu/mL。进一步优选的，所述试剂盒还包括LB琼脂平板。本专利技术的有益效果：本专利技术所述溶藻弧菌的鉴定方法，利用噬菌体对宿主菌的特异性侵染和裂解原理，使用烈性溶藻弧菌噬菌体来鉴定溶藻弧菌，能够快速准确的鉴定溶藻弧菌，具有效率高，成本低廉，省事省力的特点，准确率达到100％。本专利技术将包括烈性溶藻弧菌噬菌体作为鉴定溶藻弧菌的试剂盒，成本低廉，能够准确快速的对溶藻弧菌进行鉴定，使用方便，适于大量溶藻弧菌的初步筛选和鉴定。附图说明图1为实施例1溶藻弧菌鉴定体系噬菌斑的照片。具体实施方式本专利技术提供了一种用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法，包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为溶藻弧菌。本专利技术对所述待检菌种的来源没有限定，在本专利技术具体实施过程中，所述待检菌种可从环境样品中分离，例如水样、土样或者动物组织等。所述待检菌种优选的为分离纯化后的纯菌，更优选的为弧菌。所述待检菌在鉴定前优选的进行培养，所述待检菌的培养时间优选的为8～12h；所述培养的方法和条件采用本领域常规的菌种筛选过程中的培养方法和条件即可。所述待检菌的浓度优选的为107～109cfu/mL，更优选为108cfu/mL。在本专利技术中，将待检菌涂布于LB琼脂平板上，所述涂布优选的在无菌环境中进行，具体的可在无菌操作台中进行。在本专利技术中，所述待检菌种的涂布体积优选为100～200μl，更优选的为120～180μl，进一步为150μl。所述待检菌涂布于LB琼脂平板后，静置。所述静置的时间优选的为15～20min，更优选为16～18min。本专利技术在所述静置后获得待检平板。本专利技术在获得待检平板后，将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至待检平板上，获得鉴定体系。在本专利技术中，所述烈性溶藻弧菌噬菌体优选的为含有10种以上烈性溶藻弧菌噬菌体的混合液，更优选为含有15～20种烈性溶藻弧菌噬菌体的混合液；所述的烈性溶藻弧菌噬菌体的效价优选的为108～1010pfu/mL，更优选的为109pfu/mL。本专利技术中所述溶藻弧菌噬菌体的滴加体积优选的为20～50μl，更优选为30～40μl。本专利技术中，所述烈性溶藻弧菌噬菌体优选分离自南美白对虾养殖池。在本专利技术中，所述溶藻弧菌噬菌体的获取方法包括以下步骤：S1、将分离到的溶藻弧菌噬菌体与宿主菌溶藻弧菌混合培养获得培养液；S2、将培养液固液分离，收集液相组分为溶藻弧菌噬菌体。在本专利技术中，所述宿主菌溶藻弧菌可以是市售的菌种也可以是自制分离纯化的菌种；具体的在本专利技术实施过程中所述宿主菌溶藻弧菌来源于南美白对虾的病虾肠道或肝胰腺。本专利技术在溶藻弧菌噬菌体与宿主菌溶藻弧菌混合培养前，优选的对宿主菌溶藻弧菌进行培养。在本专利技术中所述宿主菌溶藻弧菌优选为固体单菌落接种或者种子液进行接种。当所述的宿主菌为固体单菌落接种时，优选的在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，培养温度优选的为28～35℃，更优选的为30～33℃；所述培养转速优选的为50～200rpm，更优选的为100～180rpm；培养时间优选的为14～18h，更优选为15～17h。当所述宿主菌为种子液接种时，优选的在无菌条件下将4℃保藏的种子液接种于液体培养基中进行培养；所述种子液的接种量优选的为10～20％(体积)，更优选的为12～18％；所述种子液的密度优选为106～108CFU/mL，更优选的为107CFU/mL；所述培养时间优选的为10～16h，更优选的为12～14h；所述液体接种培养时的培养温度、转速与固体单菌落接种培养时一致，在此不再赘述。本专利技术对所述液体培养的培养基没有特殊限定，采用本领域常规的溶藻弧菌培养基即可，在本专利技术具体实施例中优选为LB液体培养基。本专利技术对所述溶藻弧菌噬菌体与宿主菌溶藻弧菌混合培养的培养条件没有特殊限定，采用本领域常规的溶藻弧菌的培养条件即可，具体实施过程中采用上述溶藻弧菌宿主菌的培养条件即可。在本专利技术中所述固液分离的方法优选的为离心；所述离心的转速优选的为1000～12000rpm，更优选的为3000～8000rpm；所述离心的时间优选的为5～20min，更优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法，包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为溶藻弧菌。

【技术特征摘要】
1.一种利用烈性溶藻弧菌噬菌体快速鉴定溶藻弧菌的方法，包括以下步骤：1)将待检菌种涂布于LB琼脂平板上，静置15～20min，获得待检平板；2)将烈性溶藻弧菌噬菌体滴加至所述待检平板上，获得鉴定体系；3)将所述步骤2)中获得的鉴定体系在28～35℃下静置培养8～16h，如果有噬菌斑出现，则待检菌种为溶藻弧菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述烈性溶藻弧菌噬菌体为含有10种以上烈性溶藻弧菌噬菌体的混合液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述待检菌种的浓度为107～109cfu/mL，涂布体积为100～200μl。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的烈性溶藻弧菌噬菌体的效价为108～1010pfu/mL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宗然，付汉清，郭立，
申请(专利权)人：厦门昶科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35