一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用，涉及生物技术领域。用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，以待检样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1‑3之一所述引物组合物进行PCR扩增，从而确定待检样品中是否存在猪圆环病毒3型。采用本发明专利技术引物组合物及检测方法，能够快速、准确、灵敏的检测出样品中是否存PCV3。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物及其应用。
技术介绍
2015年6月，从美国北卡罗来纳州分离出一种新型猪圆环病毒，猪圆环病毒3型(PCV3)。猪圆环病毒3型属于圆环病毒科(Circinoviridae)、圆环病毒属，基因组长度为2000bp；同PCV2一样，PCV3可以引起猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)以及繁殖障碍(reproductivefailure)等。回溯性流行病学调查结果表明，PCV3于2010-2016年间已经在美国猪场普遍存在。2017年，我国学者首次报道从我国的10个省市的样品中检测到PCV3感染，且中国PCV3/CN/Hubei-618/2016、PCV3-China/GD2016毒株与美国PCV3毒株的同源性分别为99.1-99.6％和97.4-98.5％；继而有了从我国部分省市猪场相继检测到PCV3感染的报道，PCV3在我国猪场已普遍存在。现有技术中检测PCV3的方法在准确性、灵敏度方面还不能满足要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，采用该引物组合物，能够快速、准确、灵敏的检测出样品中是否存PCV3。本专利技术的另一目的是提供用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒。本专利技术的再一目的是提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO:2所示。在本专利技术中，所述上游引物和下游引物的摩尔浓度之比为1:1。在本专利技术中，所述上游引物的浓度为10μmol/L，下游引物的浓度为10μmol/L。本专利技术还提供用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，含有所述引物组合物。本专利技术还提供以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，以待检样品中提取的总DNA为模板，采用权利要求1-3之一所述引物组合物进行PCR扩增，从而确定待检样品中是否存在猪圆环病毒3型。优选的技术方案中，PCR体系中上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL、2×mix12.5μL、无菌ddH2O9.5μL。优选的技术方案中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸65s，扩增35个循环；72℃延伸7min。本专利技术用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物或试剂盒，能够快速、准确、灵敏地检测出样品中是否存在PCV3。本专利技术以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方法，能够快速、准确、灵敏地检测出样品中是否存在PCV3。附图说明图1PCV3PCR扩增结果，M.2000bpDNAMarker；1.阴性对照；2.PCV3扩增产物。图2PCR特异性检测结果，其中M.2000bpDNAMarker；1.PCV3；2.CSFV；3.PRRSV；4.PRV；5.PPV；6.PCV1；7.PCV2；8.阴性对照图3PCR敏感性检测结果，其中M.2000bpDNAMarker；泳道1-6的PCR产物对应的模板浓度依次为：1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL；7.阴性对照。具体实施方式实施例1采用本专利技术引物组合物检测PCV3运用Primer5.0软件，根据GenBank中已登录的PCV3全基因序列设计一对特异性引物：上游引物PCV3A2F和下游引物PCV3A2R。上游引物PCV3A2F(SEQIDNO:1)的序列如下：5’-CAGCTGTGGGCCTCCTAATGAAT-3’；下游引物PCV3A2R(SEQIDNO:2)的序列如下：5’-CCCCCGTGGCTTGAAATACAG-3’。PCV3A2F和PCV3A2R由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，扩增的目的片段长度为932bp。用TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒(北京天恩泽公司)，按说明书的方法提取PCV3的DNA。以PCV3的DNA为模板，以PCV3A2F和PCV3A2R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25.0μL：10μmol/L的上游引物1.0μL、10μmol/L的下游引物1.0μL、模板DNA1.0μL、2×mix12.5μL、无菌ddH2O9.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸65s，扩增35个循环；72℃延伸7min。同时，以无菌ddH2O作为阴性对照。2×mix、2000bpDNAMarker购自广州东盛生物科技有限公司。取10μLPCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。琼脂糖购自台湾生工生物工程服务有限公司。PCR扩增产物与理论值大小相符(932bp)，阴性对照成立(图1)。将样品的PCR扩增条带经TA克隆后进行测序，并将测序结果与GenBank中登录的PCV3美国毒株SD2016株及中国毒株Hubei-618株基因序列进行比较，结果显示样品的扩增条带为PCV3特异性条带，与美国毒株SD2016株的同源性为99％，与中国Hubei-618株的同源性为99.5％。实施例2采用本专利技术引物组合物检测PCV3的特异性采用上游引物PCV3A2F和下游引物PCV3A2R(序列同实施例1)，分别对下述样品进行检测：PCV3、PCV1、PCV2、猪瘟病毒、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒。以ddH2O为阴性对照，以检测采用本专利技术引物组合物的PCR方法的特异性。用TIANDZ柱式病毒DNAout试剂盒(北京天恩泽公司)，按说明书的方法分别提取PCV3、PCV1、PCV2、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的DNA。以各病毒的DNA为模板，以PCV3A2F和PCV3A2R为引物进行PCR扩增。PCR体系和反应条件同实施例1。取各病毒的PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。结果如图2。可以看到采用本专利技术引物组合物能从PCV3中扩增出932bp的特异性目的片段，而对PCV1、PCV2、猪瘟病毒、猪繁殖性呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒以及阴性对照均扩增不出目的片段。上述结果说明，采用本专利技术引物组合物检测PCV3具有较高的特异性。实施例3采用本专利技术引物组合物检测PCV3的灵敏度将实施例1中以PCV3的DNA为模板获得的PCR产物切胶回收，然后进行TA克隆，用胶回收试剂盒纯化扩增出的目的片段，并与pMD19-TVector连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ中，获得携带PCV3目的片段的重组质粒PCV3-TA。提取质粒，测质粒浓度。将重组质粒做10倍梯度连续稀释后，取1μL作为PCR反应模板。PCR反应体系及条件同实施例1。测定最低检出率，判断该PCR方法的敏感性。取各浓度重组质粒的PCR产物，用1％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测。由图3可以看出，采用本专利技术引物组合物可检测到的最低质粒浓度为1copy/μL，具有较高的敏感性。与现已报道的其他PCR方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQIDNO:1所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，其特征在于所述上游引物和下游引物的摩尔浓度之比为1:1。3.根据权利要求1或2所述用于检测猪圆环病毒3型的引物组合物，其特征在于所述上游引物的浓度为10µmol/L，下游引物的浓度为10µmol/L。4.用于检测猪圆环病毒3型的试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3之一所述引物组合物。5.以非诊断为目的的检测猪圆环病毒3型的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖琦，何孔旺，茅爱华，汪伟，俞正玉，郭佳慧，温立斌，胡屹屹，朱雪蛟，李彬，郭容利，范宝超，周萍，曲梦，倪艳秀，周俊明，祝昊丹，王丹丹，张雪寒，张碧成，吕立新，沈江萍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32