呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物探针及试剂盒技术方案

本公开涉及一种呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物探针及试剂盒，所述七种流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和腺病毒。本公开还提供了一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了呼吸系统常见病原体检测的敏感性、特异性和简便性。

【技术实现步骤摘要】
呼吸系统常见的七种流感病毒病原体实时荧光多重PCR引物探针及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及呼吸系统常见的七种流感病毒病原体的实时荧光多重PCR引物探针及快速检测试剂盒。
技术介绍
呼吸道感染疾病常见于成人和儿童当中，具有很高的发病率和死亡率。急性上呼吸道和下呼吸道的感染主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。临床上常见的呼吸道病毒有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感I型病毒、副流感II型病毒及副流感III型病毒。由于这些病毒引起的感染症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。病毒分离培养仍是呼吸道病毒感染诊断的金标准，但传统病毒培养存在周期长、运输和存贮过程中不易保存病毒感染性等问题。自上个世纪90时代初期开始，载玻片培养法作为检测病毒应用于临床试验，比起病毒分离法的检测时间大大缩短，由原来的8-10d缩短至1-2d，但由于病毒繁殖具有严格的嗜宿主性，因此病毒分离培养需要根据不同病毒选择合适的敏感细胞，具有一定的局限性。经典的血清学试验，如中和试验、补体结合试验等，高效省时、特异性强、灵敏度高、适用于大量样本检测，但检测中经常会出现假阳性反应、降低检测的灵敏度，并且制备抗血清的时间较长且利用该方法一次只能检测一种病毒。免疫学技术也是国内外常用的呼吸道病毒的检测技术，最常用的是采用酶联免疫吸附试验，其敏感性高、特异性强、无放射性污染，应用范围很广。但结果判读影响因素较多，很容易造成结果失真，对样本量有要求等缺点。基于聚合酶链反应的分子诊断方法具有快速、灵敏、特异等显著特点，已经成为呼吸道病毒检测的新标准。但是因为一次检测能够鉴定的病毒种类有限，仍旧比较耗费人力、试剂和时间，并且需要对每一次检测做好质量控制，保证检测结果的均一性。现有技术中并没有同时检测以上六种病毒的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决多种呼吸道病毒同时检测与鉴定的问题，提供一种七种流感病毒的荧光定量PCR引物探针组和试剂盒，同时准确鉴定七种呼吸系统常见病原体，建立一种基于荧光定量PCR平台的多重PCR检测方法。为达到以上目的，本专利技术提供一种多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组，包括组分A和组分B，其中，所述组分A包括：SEQIDNO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，SEQIDNO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，SEQIDNO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，SEQIDNO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，SEQIDNO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，具有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；其中，所述组分B包括：SEQIDNO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，SEQIDNO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，具有SEQIDNO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，SEQIDNO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，具有SEQIDNO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，SEQIDNO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，具有SEQIDNO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。所述七种流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、呼吸道合胞病毒和腺病毒。本公开的第二个方面提供一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总核酸；(2)以所述总核酸为PCR模板，利用本公开第一个方面所述的引物探针组对所述PCR模板进行多重荧光定量PCR扩增；其中，所述多重荧光定量PCR同时在两个体系中进行，在第一个体系中，利用所述组分A对所述PCR模板进行第一扩增，在第二个体系中，利用所述组分B对所述PCR模板进行第二扩增；(3)分别收集第一个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号，收集第二个体系中CY5、VIC、FAM和ROX荧光通道信号。本公开的第三个方面提供一种多重荧光定量PCR检测七种流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。本专利技术建立的副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和甲型流感病毒七重实时荧光PCR检测方法，能够对常见的呼吸道毒感染进行快速、准确的检测，以便进行及时治疗，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：(一)多重检测本专利技术所建立的检测方法能够在不超过2次PCR反应中同时筛查副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和甲型流感病毒，快速简便确认呼吸道病毒感染的病原种类，节省时间、人力和试剂成本。(二)灵敏度高本专利技术所建立的检测方法能够实现超过7个基因的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到102PFU/ml，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当。(三)特异性高本专利技术所建立的检测方法特异性主要体现在一整套特异性引物探针，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅在本专利技术中检测目标能够相互区分，而且还能与核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物区别开，这包括人冠状病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、无毒结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、唾液链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、乳杆菌、卡他莫拉菌、淋球菌、铜绿假单胞杆菌、表皮葡萄球菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。(四)预防假阴性结果体系中添加的IAC，可以有效的提示假阴性检测结果。本专利技术为呼吸道传染临床样本中副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病本文档来自技高网...

【技术保护点】
多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组，其特征在于，包括组分A和组分B，其中，所述组分A包括：SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；其中，所述组分B包括：SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，具有SEQ ID NO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，SEQ ID NO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，具有SEQ ID NO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。...

【技术特征摘要】
1.多重PCR检测七种流感病毒用引物探针组，其特征在于，包括组分A和组分B，其中，所述组分A包括：SEQIDNO.1所示核苷酸序列的副流感病毒I型上游引物，SEQIDNO.2所示核苷酸序列的副流感病毒I型下游引物，具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的副流感病毒I型探针，所述副流感病毒I型探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO.4所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型上游引物，SEQIDNO.5所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型下游引物，具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅱ型探针，所述副流感病毒Ⅱ型探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.7所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型上游引物，SEQIDNO.8所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型下游引物，具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的副流感病毒Ⅲ型探针，所述副流感病毒Ⅲ型探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.10所示核苷酸序列的乙型流感病毒上游引物，SEQIDNO.11所示核苷酸序列的乙型流感病毒下游引物，具有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的乙型流感病毒探针，所述乙型流感病毒探针的5’端标记有ROX发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2；其中，所述组分B包括：SEQIDNO.13所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒上游引物，SEQIDNO.14所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒下游引物，具有SEQIDNO.15所示核苷酸序列的呼吸道合胞病毒探针，所述呼吸道合胞病毒探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；SEQIDNO.16所示核苷酸序列的腺病毒上游引物，SEQIDNO.17所示核苷酸序列的腺病毒下游引物，具有SEQIDNO.18所示核苷酸序列的腺病毒探针，所述腺病毒探针的5’端标记有VIC发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.19所示核苷酸序列的甲型流感病毒上游引物，SEQIDNO.20所示核苷酸序列的甲型流感病毒下游引物，具有SEQIDNO.21所示核苷酸序列的甲型流感病毒探针，所述甲型流感病毒探针的5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：林笑冬，凌明玉，王雷，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11