一种检测马尔堡病毒的引物、探针及试剂盒制造技术

本公开公开了重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了对马尔堡病毒检测的敏感性、特异性和简便性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测马尔堡病毒的引物、探针及试剂盒
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种检测马尔堡病毒用引物探针组及试剂盒和检测方法。
技术介绍
马尔堡出血热是由马尔堡病毒(Marburgvirus,MARV)引起的，可经人与人之间的亲密接触传播，传染性强，病死率高。自1967年马尔堡出血热首次暴发和确认来，已有40年的流行史，期间有3次大规模暴发。马尔堡出血热以其高传染性的暴发流行和高致死性，使得人们日益关注马尔堡出血热对人类健康和公共卫生安全的潜在威胁。马尔堡出血热的初期症状与疟疾、SARS、流感或黄热病等相似，晚期症状与埃博拉出血热、拉沙热、肾综合征出血热、登革热等类似，单靠临床症状难以与其他病原体鉴别诊断，因此马尔堡病毒需要通过实验室手段确诊。常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规PCR、ELISA等方法。传统检测方法中，病毒分离培养是检测金标准，但同时存在以下缺点：1、马尔堡病毒培养须在P4实验室进行，对实验条件要求高；2、细胞培养检测结果判定受主观因素干扰较大；3、从接种病毒到出现明显的细胞病变需要较长时间；4、同一时期无法处理大量样本。而免疫学检测中，其ELISA检测的灵敏度较低，且难以避免“窗口期”问题，不能反映病毒早期感染，复制状态及预后信息，常造成假阴性结果，延误病情。目前国内外均建立了采用PCR技术对马尔堡病毒进行快速检测的方法。虽然实时荧光PCR有较高的敏感性和特异性，但是常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，且耗时较长，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因此，基于疫情的快速暴发、传播范围广的特点，建立灵敏度高、特异性强、检测时间短、检测成本低、操作简单方便、器材要求不高的马尔堡病毒检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有非常重要意义。对公共卫生和疫情防控具有重要的价值意义。
技术实现思路
本公开的目的是解决现有技术中不能对马尔堡病毒进行快速、灵敏和特异检测的缺陷，提供一种马尔堡病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术的马尔堡病毒的快速、灵敏、特异、简便的检测方法。为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有FAM发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团BHQ1。本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有马尔堡病毒。对于临床样本，若FAM、VIC通道均无扩增曲线，提示假阴性结果。本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。本专利技术的有益效果在于：本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测马尔堡病毒的检测方法，能够实现形态学、免疫学以及实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)耗时短逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而RT-PCR、Real-timePCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。(二)对仪器平台要求低RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了马尔堡病毒的现场应急检测。(三)特异性好RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-timePCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本专利技术所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括汉坦病毒、汉城病毒、安第斯病毒、辛德毕斯病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(四)最低检出限本专利技术所建立的检测方法的最低检出限可达到5拷贝/反应。(五)成本较低本专利技术所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测马尔堡病毒的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件仅为一步39℃，无需复杂操作。(六)预防假阴性结果本专利技术反应体系中添加的检测内质控引物，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下内容对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有FAM发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团BHQ1。本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段能够全面覆盖马尔堡病毒。而且设计过程中要充分考虑避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于RPA对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。表1马尔堡病毒RPA检测引物探针汇总表检测马尔堡病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。检测内质控的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。依据VIC荧光通道有无扩增曲线，排除临床样本中假阳性结果。在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(PRA)检测马尔堡病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集检测通道荧光信号，得到检测结果；a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有马尔堡病毒。b)对于临床样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1‑2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有FAM发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团BHQ1。

【技术特征摘要】
1.重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒用引物探针组，其特征在于，包括具有SEQIDNO.1-2所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有FAM发光基团，第20位碱基后连接脱碱基位点，第22位碱基标记淬灭基团BHQ1。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括具有SEQIDNO.4-5所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。3.一种重组酶聚合酶扩增检测马尔堡病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以所述总RNA为模板，并使用权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓艳，王雷，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11