检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组制造技术

本公开提供了重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案能显著地提高对三种感染人的禽流感病毒亚型检测的敏感性、特异性和简便性。

【技术实现步骤摘要】
检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染病，由于其具有众多的血清型，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性，导致频繁爆发禽流感疫情，严重威胁禽类养殖业。根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶结构的不同，禽流感病毒分为16种HA亚型和9种NA亚型，共可产生144种不同的病毒亚型组合。其中H5、H7和H9等几个亚型对家禽最为致命，也能引起人类感染，是感冒病毒中致病性较高的亚型。H5和H7亚型的某些毒株可以造成禽类很高的发病率和死亡率，被称为高致病性禽流感(HPAI)病毒，高致病性禽流感可导致高达100％的发病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡。因此建立快速、准确、简便、特异的禽流感检测和分型技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有重要意义。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种禽流感病毒H5、H7和H9亚型检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术的禽流感病毒H5、H7和H9亚型的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.7-9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA；(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H5亚型；b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H7亚型；c)若CY5荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有禽流感病毒H9亚型。本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。本专利技术的有益效果在于：本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型的检测方法，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)耗时短逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应约20min即可完成，而RT-PCR、Real-timePCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。(二)对仪器平台要求低RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了禽流感病毒H5、H7、H9亚型的现场应急检测。(三)特异性好RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-timePCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本专利技术所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括甲型H1N1流感病毒、H3亚型人类流感病毒、乙型流感(Victoria和Yamagata系)、副流感病毒1、2、3、4型，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒A型、B型，人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU1、人偏肺病毒、人博卡病毒以及埃博拉病毒、MERS病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。(四)最低检出限本专利技术所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。(五)成本较低本专利技术所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件可以仅为一步39℃，无需复杂操作。(六)预防假阴性结果本专利技术反应体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其中，包括具有SEQIDNO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.7-9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段分别能够全面覆盖禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型。而且设计过程中要充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到Tm值一致性、GC含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于RPA对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。表1禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型检测引物探针检测禽流感病毒H5型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.7所示。检测禽流感病毒H7型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.8所示。检测禽流感病毒H9型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.5、SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其特征在于，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。

【技术特征摘要】
1.重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的引物探针组，其特征在于，包括具有SEQIDNO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.7-9所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有VIC发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1；SEQIDNO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有CY5发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ3。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其中，还包括具有SEQIDNO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的探针；其中，SEQIDNO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有ROX发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团BHQ1。3.一种重组酶聚合酶扩增检测禽流感病毒亚型H5、H7和H9的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，王彦威，王晓艳，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11