本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。本发明专利技术所述基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，是根据AIV的H5型N1、N2、N6基因序列设计的引物，该引物体系可特异性的对H5N1、H5N2、H5N6型病毒进行特异性检测。并且本发明专利技术基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行AIV检测的等温扩增基因方法体系，能够快速准确的对AIV病毒进行检出，该方法的最低检出病毒量为0.1LD50，灵敏度与传统RT‑PCR一致，且该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。
【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。
技术介绍
禽流感是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的一种急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类疾病，我国更将其列为一类动物疫病，给养禽业造成巨大经济损失。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，将血凝素(HA)分为16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶(NA)分为9个亚型(N1-N9)，不同亚型的病毒根据上述分类予以命名。AIV病毒的常用检测方法包括血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、以及RT-PCR法等。上述方法中，HI、琼脂扩散试验等方便虽然检测快捷，但该方法的敏感性较低，通常不适宜于微量病毒的检测；ELISA以及荧光抗体法的检测技术较为成熟，但其敏感性仍然低于RT-PCR方法。RT-PCR方法用于检测AIV病毒具有检测结果敏感性高的优点，但是常规RT-PCR检测必须经过变性、退火、延伸至少三个步骤，不仅过程较为繁琐，而且需要特殊的基因扩增仪器，检测便捷性较差。重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。英国公司TwistDxInc以此为基础开发的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测，这无疑能大大加快基因扩增的速度。并且该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测，利用RPA技术进行AIV病毒不同亚型的特异性检测，也成为代替RT-PCR检测技术的理想方法。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，并进一步公开了一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：特异性扩增位于AIVHA5型基因的第127-671位点之间片段的引物H5，以及特异性扩增位于NA1型基因的第1033-1460位点之间片段的引物N1，和/或特异性扩增位于NA2型基因的第825-1051位点之间片段的引物N2，和/或特异性扩增位于NA6型基因的第873-1197位点之间片段的引物N6。进一步的，所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；以及，上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；和/或，上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；下游引物N2-R：5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’；和/或，上游引物N6-F：5’-GGAGCAKCAGRGATGATCAA-3’；下游引物N6-R：5’-GATTGAGTGTCGRTYTCTG-3’。本专利技术还公开了所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物用于特异性检测AIV病毒的用途。本专利技术还公开了一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法，包括如下步骤：(1)RNA提取：按照现有技术方法提取待测组织的RNA；(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，利用权利要求1或2所述的特异性引物进行等温基因扩增，获得扩增产物；(3)将所述扩增产物进行凝胶电泳，依据凝胶电泳结果进行待测组织病毒类型的判断。所述步骤(2)中，所述等温基因扩增的反应体系包括：所述步骤(2)中，所述等温基因扩增的反应的扩增条件为：40℃、扩增反应15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃，反应35min。所述步骤(1)中，所述RNA提取步骤具体包括：取待测组织用PBS以1∶10研磨成悬液，装入高压灭菌处理过的1.5mLEP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g/min离心10min，随后进行倍比稀释至10-8；分别取300μL于2mL离心管中，加入900μLTRIZOL试剂，剧烈颠倒60-100次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒6-10次，室温静置5min，4℃、10000×g/min离心10min，取上清移入1.5mL离心管中；随后加入同体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放30min，于4℃、10000×g/min离心10min；倒掉上清，加入1mL75％的乙醇-DEPC水溶液，4℃、10000×g/min离心5min；去掉上清，于4℃、12000×g/min离心5min，用微量移液器吸去管底部的液体，在超净工作台中干燥5min，随后用适量0.1％DEPC水溶解RNA，-20℃冻存。所述步骤(1)中，所述乙醇为DEPC水溶液配制的乙醇溶液。所述步骤(3)中，所述对待测组织病毒类型的判断标准为：观察凝胶电泳结果，若出现317bp条带，可判断为AIV阳性；若出现545bp和428bp两条带，可判断为H5N1型病毒；若出现545bp和227bp两条带，可判断为H5N2型病毒；若出现545bp和325bp两条带，可判断为H5N6型病毒；若同时出现以上三条或四条带可作相应判断。本专利技术还公开了一种基于RPA技术检测AIV病毒亚型的试剂盒，包括所述的特异性引物。本专利技术所述基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，是根据AIV的H5型N1、N2、N6基因序列设计的引物，该引物体系可特异性的对H5N1、H5N2、H5N6型病毒进行特异性检测。并且本专利技术基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行AIV检测的等温扩增基因方法体系，能够快速准确的对AIV病毒进行检出，该方法的最低检出病毒量为0.1LD50，灵敏度与传统RT-PCR一致，且该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中，图1为本专利技术AIV病毒检测的检测电泳结果；图2是禽流感病毒多重RT-PCR检测电泳结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-H5N1/H5N2/H5N6；2-H5N1；3-H5N2；4-H5N6；5-禽流感H9；6-新城疫；7-禽白血病；8-鸡传染性支气管炎；9-禽脑脊髓炎；10-禽气管、脑和肝脏等组织混合物；图3是禽流感病毒重组酶聚合酶等温检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3-10LD50；4-1LD50；5-0.1LD50；6-0.01LD50；图4是禽流感病毒RT-PCR检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-103LD50；2-102LD50；3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：特异性扩增位于AIV HA5型基因的第127‑671位点之间片段的引物H5，以及特异性扩增位于NA1型基因的第1033‑1460位点之间片段的引物N1，和/或特异性扩增位于NA2型基因的第825‑1051位点之间片段的引物N2，和/或特异性扩增位于NA6型基因的第873‑1197位点之间片段的引物N6。
【技术特征摘要】
1.一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：特异性扩增位于AIVHA5型基因的第127-671位点之间片段的引物H5，以及特异性扩增位于NA1型基因的第1033-1460位点之间片段的引物N1，和/或特异性扩增位于NA2型基因的第825-1051位点之间片段的引物N2，和/或特异性扩增位于NA6型基因的第873-1197位点之间片段的引物N6。2.根据权利要求1所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；以及，上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；和/或，上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；下游引物N2-R：5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’；和/或，上游引物N6-F：5’-GGAGCAKCAGRGATGATCAA-3’；下游引物N6-R：5’-GATTGAGTGTCGRTYTCTG-3’。3.权利要求1或2所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物用于特异性检测AIV病毒亚型的用途。4.一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)RNA提取：按照现有技术方法提取待测组织的RNA；(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，利用权利要求1或2所述的特异性引物进行等温基因扩增，获得扩增产物；(3)将所述扩增产物进行凝胶电泳，依据凝胶电泳结果进行待测组织病毒类型的判断。5.根据权利要求4所述的基于RPA技术的AIV核酸检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述等温基因扩增的反应体系包括：6.根据权利要求5所述的基于RPA技术的AIV核酸检测方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭效珍，高月花，胡峰，于可响，刘存霞，李玉峰，刘玉山，史玉颖，黄兵，马秀丽，路晓，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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