【技术实现步骤摘要】
荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法
本专利技术涉及一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,属于干扰素活性检测
技术介绍
干扰素τ广泛应用于抗病毒感染和免疫功能障碍方面的疾病治疗,其作为一种细胞因子通过与靶细胞表明的特定受体结合引起细胞内系列信号转导途径的激活,表现出抗病毒作用或免疫调节作用。目前干扰素τ在细胞内起作用的信号转导途径已经研究的比较透彻,主要是通过激活JAK-STAT信号级联来实现的。干扰素τ与受体结合激活受体相关JAK1和TYK2,使STAT1和STAT2络氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1和STAT2形成二聚体并转移入核,装配干扰素调节因子9(IRF9)形成3聚体的干扰素刺激因子3(ISGF3)。ISGF3与其同源DNA序列(干扰素刺激反应原件,ISREs)结合,直接激活干扰素刺激基因(ISGs)转录,使宿主细胞进入抗病毒状态。ISG抑制病毒的途径主要有,抑制病毒的转录、翻译和核酸复制;降解病毒核酸;改变宿主细胞脂代谢。因此,只要检测到ISGs的启动子活性增加就可以直接反应干扰素τ的生物学活性。Mx蛋白(Mxprorein)是主要的ISGs,干扰素τ可以经JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mxpromoter,pMx),促进Mx的表达,Mx能够抑制负链RNA病毒复制。在羊中存在Mx1和Mx2两种蛋白,其中Mx1起主要作用。pMx有较好的专一性,它不能被白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor,TNF)等其它细胞因子启动。目前检测干扰素生物学活性主要有3 ...
【技术保护点】
一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,其包括以下步骤:采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段;将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3‑basic载体luc基因的5'端,再采用PCR扩增得到pMx1‑luc融合基因片段;用pMx1‑luc融合基因片段替代pEGFP‑N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段,构建pMx1‑luc质粒;用pMx1‑luc质粒转染细胞,并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株;对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养;以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线,确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系;将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中,然后检测荧光强度,结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。
【技术特征摘要】
1.一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,其包括以下步骤:采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段;将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端,再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段;用pMx1-luc融合基因片段替代pEGFP-N1载体中的pCMV和EGFP的基因片段,构建pMx1-luc质粒;用pMx1-luc质粒转染细胞,并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株;对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养;以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线,确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系;将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中,然后检测荧光强度,结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。2.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,其特征在于:pMx1的基因片段序列为序列1所示;pMx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。3.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,其特征在于,采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段的步骤包括:根据Genebank中已公布的羊Mx1蛋白的基因序列,选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域,设计PCR引物,进行PCR扩增,得到扩增产物;将扩增产物进行双酶切,再通过切胶回收纯化获得pMx1的基因片段;优选的,采用PCR扩增获取羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为KpnI和HindIII。4.根据权利要求1所述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法,其特征在于,将PCR扩增获得的羊Mx1蛋白的pMx1的基因片段插入pGL3-basic载体luc基因的5'端,再采用PCR扩增得到pMx1-luc融合基因片段的步骤包括:通过T4DNA连接酶将pMx1的基因片段连入pGL3-Basic质粒luc基因的5'端;转化大肠杆菌DH5τ感受态细胞,摇菌,筛选出阳性克隆后提取重组pGL3-basic质粒,通过DNA测序获得重组pGL3-basic质粒的pMx1片段的DNA序列,选择含正确序列的重组pGL3-basic质粒;以含正确序列的重组pGL3-basic质粒的DNA序列为模板,设计PCR引物,进行PCR扩增,得到产物;将产物进行双酶切,再通过切胶回收纯化获得pMx1-luc融合基因片段;优选...
【专利技术属性】
技术研发人员:张振韬,赵俊,王明丽,蒋敏之,梅志强,甘霖,王利利,赵雨,
申请(专利权)人:芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽,34
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