一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034 的方法、引物和探针及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法、引物和探针及应用，涉及分子生物学及转基因检测技术领域。所述的引物和探针分别包括外源基因Cry1Ie和内参基因rubisco的引物和探针，所述定量分析方法包括：1)提取饲料样品基因组DNA；2)利用外源基因Cry1Ie和内参基因rubisco的特异性引物和探针，对稀释后的基因组DNA进行ddPCR扩增；3)PCR产物的检测与分析。本方法不依赖于标准曲线、不受PCR抑制物及PCR扩增效率的影响，与常规PCR相比具有更高的灵敏度和稳定性，能够精准定量检测饲料中转基因的拷贝数浓度，能够对饲料中转基因玉米IE034定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法、引物和探针及应用
本专利技术属于分子生物学及转基因检测检测
，具体涉及饲料中转基因玉米IE034的微滴式数字PCR定量检测方法。
技术介绍
2016年，全球转基因作物的种植面积从1996年的170万公顷增加到1.851亿公顷，其中转基因玉米的种植面积为6060万公顷，占全球玉米总种植面积的64％，应用率为26％。截止到2016年，共有40个国家/地区的监管机构批准转基因作物用作粮食和/或饲料以及释放到环境中，在获准的3768项监管审批中有1238项涉及饲料用途，其中包括直接用途或加工用途，用于饲料的转基因作物占比约为33％。玉米是重要的饲料原料，随着饲料加工及工业酒精对玉米需求的增长，转基因玉米在转基因作物种植中所占比重还会逐年增加。我国是转基因玉米进口大国，2015年进口量为330万吨玉米，目前正在加快转基因作物种植的审批，以提高玉米生产率并且减少对数量不断增长的进口转基因玉米的依赖。转基因作物商业化种植给全球带来了巨大的社会和经济效益，同时其潜在的安全问题也引起了人们的极大关注。目前，已有60多个国家制定了对含有转基因成分或由转基因作物加工而成的产品进行标识的制度，而且随着消费者对转基因产品关注度的日益提高，更加强调了对转基因成分进行定量检测的重要性，如何准确、精确地确定转基因作物及其产品中的外源基因，已经成为现今转基因产品检测技术研究的一个关键点，也是转基因生物安全评价的重要参数。目前，通常采用实时荧光定量PCR(qPCR)对转基因玉米IE034中的转基因成分进行定量检测。经检索，现有技术已经公布了相关的技术方案，中国专利号201410457457.5，公开日为2014.12.10的申请案公开了转基因玉米IE034的转化体特异性定量PCR检测引物和探针及方法，其设计了上游引物序列、下游引物序列及荧光探针序列进行PCR扩增，虽然该实时荧光定量PCR的方法能够对转基因玉米IE034及其衍生品种进行特异性定量检测，然而依然存在一定的缺陷：在分析外源基因拷贝数时，实时荧光定量PCR必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响，使得检测灵敏度及精确度都达不到准确定量的要求，可能导致过低或过高估计转基因的含量。而且，由于外源基因通常是以低拷贝数(1～2个)整合到受体基因组中，在检测复杂物质中的转基因成分时，qPCR容易受到背景DNA的干扰。而近年来兴起的微滴式数字PCR(ddPCR)是一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，使得稀有的目标核酸序列与大量的背景DNA分开，提高其相对含量，进而提高了检测的灵敏度及重复性，目前该技术在转基因玉米IE034的检测领域未得到应用。因此，基于现有技术的缺陷，亟需提供一种对饲料中转基因玉米IE034精准定量检测的方法。
技术实现思路
1.解决的技术问题：基于现有PCR技术对于饲料中转基因玉米IE034的检测灵敏度及精确度都达不到准确定量的要求，本专利技术提供一种对饲料中转基因玉米IE034精准定量检测的方法。2.技术方案：本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的引物和探针，包括：外源基因Cry1Ie正向引物：5′-AGAGCTGGGTGCGCTACAAC-3′外源基因Cry1Ie反向引物：5′-ACACCAGGGTGTCGTAGCTG-3′外源基因Cry1Ie探针：5′-FAM-TTCCGCAAGGACATGACCCTGATGGT-TAMAR-3′内参基因rubisco正向引物：5′-ATGTAGCTTATCCATTAGAC-3′内参基因rubisco反向引物：5′-TTGAAACCAAATACGTTACC-3′内参基因rubisco探针：5′-FAM-ATTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACAT-TAMAR-3′作为本专利技术更进一步的改进，使用引物和探针进行PCR扩增。作为本专利技术更进一步的改进，本专利技术还提供了一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，包括以下步骤：1)、提取饲料样品的基因组DNA；2)、ddPCR扩增：以步骤1)所述的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针，分别根据外源基因Cry1Ie和内参基因rubisco设定相应的数字PCR扩增反应体系和反应程序，进行扩增反应，得到PCR扩增产物；3)、对步骤2)得到的PCR扩增产物进行检测与分析。作为本专利技术更进一步的改进，扩增基因是外源基因Cry1Ie时，将基因组DNA浓度稀释至10～100ng/μL；扩增基因是玉米内参基因rubisco时，将基因组DNA浓度稀释至1～0.1ng/μL。作为本专利技术更进一步的改进，所述步骤2)中引物和探针组合中引物浓度为10μmol/L，探针浓度为5μmol/L。作为本专利技术更进一步的改进，所述的外源基因Cry1Ie的数字PCR扩增反应体系包括：2XddPCRSupermixforProbes10μL，上下游引物各0.4μL，浓度为10μmol/L，探针0.6μL，浓度为5μmol/L，DNA模板2.5μL，无菌去离子水补足至20μL；所述的内参基因rubisco的数字PCR扩增反应体系包括：2XddPCRSupermixforProbes13.5μL，上下游引物各0.3μL，浓度为10μmol/L，探针0.2μL，浓度为5μmol/L，DNA模板3μL，无菌去离子水补足至20μL。作为本专利技术更进一步的改进，外源基因Cry1Ie的数字PCR扩增反应程序为：95℃预变性120s，95℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，总共47个循环；扩增内参基因rubisco的数字PCR扩增反应程序为：95℃预变性600s，95℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。作为本专利技术更进一步的改进，所述的步骤3)包括以下步骤：a)将所得的PCR产物置于微滴分析仪内，并在QuantSoft软件上设定检测模式为ABS，检测FAM的荧光信号；b)微滴分析仪对每个微滴逐个进行荧光检测和分析；c)由QuantSoft计算各饲料样品中外源基因和内参基因的拷贝数浓度。作为本专利技术更进一步的改进，所述方法应用于饲料中转基因玉米IE034的定量检测。3.有益效果：与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的引物和探针，能够实现对饲料中外源基因和玉米内参基因的特异性扩增，与现有技术中的转基因玉米IE034的PCR扩增相比，大幅度提高了检测方法的准确度和灵敏度。(2)本专利技术的基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，针对于现有技术中采用荧光定量PCR检测饲料中转基因玉米IE034时，容易受背景DNA中抑制剂的干扰，以及不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，导致灵敏度低、准确度较差的缺陷，实现了饲料中转基因玉米IE034基因组DNA的ddPCR扩增，该方法条件下PCR扩增产物满足ddPCR的检测条件，最终实现了饲料中转基因玉米IE034外源基因的绝对定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的引物和探针，其特征在于：包括：外源基因Cry1Ie正向引物：5′‑AGAGCTGGGTGCGCTACAAC‑3′，外源基因Cry1Ie反向引物：5′‑ACACCAGGGTGTCGTAGCTG‑3′，外源基因Cry1Ie探针：5′‑FAM‑TTCCGCAAGGACATGACCCTGATGGT‑TAMAR‑3′；内参基因rubisco正向引物：5′‑ATGTAGCTTATCCATTAGAC‑3′，内参基因rubisco反向引物：5′‑TTGAAACCAAATACGTTACC‑3′，内参基因rubisco探针：5′‑FAM‑ATTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACAT‑TAMAR‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的引物和探针，其特征在于：包括：外源基因Cry1Ie正向引物：5′-AGAGCTGGGTGCGCTACAAC-3′，外源基因Cry1Ie反向引物：5′-ACACCAGGGTGTCGTAGCTG-3′，外源基因Cry1Ie探针：5′-FAM-TTCCGCAAGGACATGACCCTGATGGT-TAMAR-3′；内参基因rubisco正向引物：5′-ATGTAGCTTATCCATTAGAC-3′，内参基因rubisco反向引物：5′-TTGAAACCAAATACGTTACC-3′，内参基因rubisco探针：5′-FAM-ATTTGAAGAGGGTTCTGTTACTAACAT-TAMAR-3′。2.一种基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的引物和探针进行PCR扩增。3.根据权利要求2所述的基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)、提取饲料样品的基因组DNA；2)、ddPCR扩增：以步骤1)所述的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针，分别根据外源基因Cry1Ie和内参基因rubisco设定相应的数字PCR扩增反应体系和反应程序，进行ddPCR扩增反应，得到PCR扩增产物；3)、对步骤2)得到的PCR扩增产物进行检测与分析。4.根据权利要求3所述的基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，其特征在于：扩增基因是外源基因Cry1Ie时，将基因组DNA浓度稀释至10～100ng/μL；扩增基因是玉米内参基因rubisco时，将基因组DNA浓度稀释至1～0.1ng/μL。5.根据权利要求3所述的基于ddPCR定量检测饲料中转基因玉米IE034的方法，其特征在于：所述步骤2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：董姗姗，刘燕，张振华，章嫡妮，于赐刚，郭晓平，
申请(专利权)人：环境保护部南京环境科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32