芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法技术

本发明专利技术提供芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法。所述特异性PCR引物Pb4871F和Pb4871R(SEQ ID NO:1‑2)是根据根肿病菌全基因组序列中保守的内转录间隔区序列设计的。该对引物可用于芸苔根肿病菌分子鉴定及病害流行动态监测，为十字花科根肿病的早期诊断及病菌检测提供了快速准确、简便有效的方法，对有效监测根肿病菌在田间的发生发展动态及根肿病的预测预报提供了重要手段和技术支持。

【技术实现步骤摘要】
芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法
本专利技术涉及根肿病菌的检测，具体地说，涉及芸苔根肿病菌的特异性PCR引物及检测方法。
技术介绍
芸苔根肿病菌(Plasmodiophorabrassicae)是一种专性寄生植物病原菌，侵染十字花科等作物引起根肿病。随着十字花科等作物种植面积的扩大，根肿病发生与为害在世界范围内日趋严重，在我国的江西、安徽、浙江、江苏、上海、北京、辽宁、吉林、黑龙江、湖南、湖北、福建、广西、云南、西藏、四川、贵州、广东等省市自治区均有发生。世界范围内每年由根肿病造成的经济损失可达10～15％。十字花科根肿病主要危害根部，形成大小不等的肿瘤，被根肿病菌侵染的植株生长缓慢，易混有腐生菌造成腐烂，伴有腥臭味。根肿病的主要传播途径包括带菌土壤、农事操作、雨水流动等方式。根肿病菌休眠孢子可在土中存活7～8年，萌发和侵染的适宜温度为18～25℃，最适土壤含水量为70％，最适土壤pH值5.4～6.5。主要的传播途径包括带菌土壤、农事操作、雨水流动等方式。在农业实践生产中，播种前的田间土壤及作物被侵染但未显症阶段，无法避免根肿病菌的侵染及病害诊断，导致十字花科根肿病一旦发生，造成病害防治十分困难。加之根肿病菌不能在人工培养基上进行培养，传统的病原鉴定研究方法无法对该病菌进行快速、简易的鉴定和诊断。近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，聚合酶链式反应(PCR)扩增技术逐渐应用到植物病害的分子鉴定、生态监测等方面，解决了许多传统技术难以解决的问题。因此，设计一套高效精准的十字花科蔬菜根肿病菌检测技术体系，可以有效的监测并预防根肿病的发生与传播，对根肿病的流行预警及病害防控等具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一对用于检测芸苔根肿病菌的特异性PCR引物。本专利技术的另一目的是提供芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术根据根肿病菌(Plasmodiophorabrassicae)全基因组序列中保守的内转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)序列(NCBIaccessionnumberKX011135.1)，设计出一对用于检测芸苔根肿病菌的特异性PCR引物Pb4871F和Pb4871R，引物序列如下：正向引物Pb4871F：5’-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3’(SEQIDNO:1)反向引物Pb4871R：5’-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3’(SEQIDNO:2)本专利技术还提供含有上述引物对的检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供上述引物对或含有上述引物对的检测试剂或试剂盒在十字花科作物及土壤中根肿病菌检测中的应用。前述的应用是指采用普通PCR或实时荧光定量PCR进行检测。本专利技术还提供芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法，包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物Pb4871F和Pb4871R进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。优选地，PCR反应体系为：PCR反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，58℃-68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共25个循环；72℃延伸8-20分钟，最后4℃保存。更优选地，退火温度为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃或68℃。最优选62℃。前述的方法，步骤3)用1.2％-1.4％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若出现244bp大小的特征条带，则表明样品中含有根肿病菌。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术基于根肿病菌全基因组序列中保守的内转录间隔区，设计出可快速检测根肿病菌的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出根肿病菌。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高(普通PCR检测灵敏度可达1fg水平，实时荧光定量PCR检测灵敏度可达1ag水平)。本专利技术提供的引物可用于芸苔根肿病菌分子鉴定及病害流行动态监测，为十字花科根肿病的早期诊断及病菌检测提供了快速准确、简便有效的方法，对有效监测根肿病菌在田间的发生发展动态及根肿病的预测预报提供了重要手段和技术支持。附图说明图1为本专利技术芸苔根肿病菌与根肿菌门中其他真菌的部分ITS序列比对结果；其中，下划线部分为引物设计位点，灰色部分为相同碱基。图2为本专利技术实施例2中PCR反应体系优化结果；其中，Lane1-4分别为反应体系10μL，20μL，50μL及ddH2O。图3为本专利技术实施例2中根肿病菌及不同物种的扩增产物核酸序列比对及聚类分析结果。图4为本专利技术实施例2中根肿病菌PCR反应条件优化结果；其中，Lane1-6分别为退火温度58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。图5为本专利技术实施例2中根肿病菌PCR反应灵敏性检测结果；其中，Lane1-8分别为DNA模板反应量10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。图6为本专利技术实施例2中根肿病菌实时荧光定量PCR反应灵敏性检测结果；其中，A，扩增曲线，表明不同模板浓度扩增反应成梯度变化；B，熔点峰图，表明不同模板均能扩增单特异峰(即唯一PCR扩增产物；图中曲线分别为DNA模板反应量10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、10ag、1ag。图7为本专利技术实施例2中根肿病菌PCR反应特异性检测结果；其中，Lane1-12分别为Plasmodiophorabrassicae，Brassicanapus，Penicilliumsp.，Alternariaalternata，Rhizoctoniasolani，Fusariumavenaceum，Botrytiscinerea，Colletotrichumdestructivum，Sclerotiniasclerotiorum，Pseudomonasfluorescens，Bacillusmegaterium，ddH2O。图8为本专利技术实施例2中对实际样品的PCR检测结果；其中，Lane1-6分别为根肿病菌休眠孢子、罹病白菜根、罹病油菜根、发病田土样、带菌种子样品，ddH2O。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1根肿病菌特异性引物的设计与合成根据芸苔根肿病菌(Plasmodiophorabrassicae)全基因组序列中保守的内转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)序列(NCBIaccessionnumberKX011135.1)，与根肿菌门中其他真菌马铃薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)、禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)、水云毛利亚菌(Maulliniaectocarpii)、吴龙氏卵菌(Woroninapythii)的部分ITS序列进行相似性比对(图1)，找到根肿病菌的特异性区域。利本文档来自技高网...

【技术保护点】
芸苔根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对为：正向引物Pb4871F：5’‑CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC‑3’反向引物Pb4871R：5’‑ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.芸苔根肿病菌(Plasmodiophorabrassicae)的特异性PCR引物对，其特征在于，所述引物对为：正向引物Pb4871F：5’-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3’反向引物Pb4871R：5’-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3’。2.含有权利要求1所述引物对的检测试剂或试剂盒。3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在十字花科作物及土壤中根肿病菌检测中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用普通PCR或实时荧光定量PCR进行检测。5.芸苔根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁月，关格格，朴钟云，孙慧颖，陈彩霞，庞文星，李晓楠，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21