用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒技术

技术编号:17770623 阅读:138 留言:0更新日期:2018-04-21 23:15
本发明专利技术公开了属于生物技术领域的一种用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒。所述检测引物对为:cry1A‑F,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A‑R,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述检测方法及检测试剂盒可作为鉴定含有cry1A基因的转基因产品。本发明专利技术的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性,对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测,该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒
本专利技术属于生物
,具体涉及一种用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
Cry1A基因是一类抗虫基因的总称,也是当前商业化应用的抗虫转基因作物中最常见的外源目的基因,包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、mcry1Ac、cry1Ab/Ac等,cry1A基因在转基因检测工作中可作为一种具有广泛代表性的靶标。但是,由于转基因作物研发者往往会对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰,导致不同转化体中的同一类型的cry1A基因在核苷酸序列上也有较大变异,因此,建立具有广泛适用性的cry1A基因定性PCR检测方法,对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种cry1A基因定性PCR检测引物。本专利技术的目的之二是建立一种cry1A基因定性PCR检测方法。本专利技术的目的之三是一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒。一种cry1A基因定性PCR检测引物,所述定性检测引物为:cry1A-F,其核苷酸序列如序列SEQIDNo.1所示;cry1A-R,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法,按照如下步骤进行:(1)DNA模板制备:提取待检测样品的DNA;(2)试样PCR反应:以提取样品的DNA为模板,利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系,并进行PCR扩增。(3)对照PCR反应:在试样PCR反应的同时,应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照;以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照;以转基因玉米MON810作为阳性对照。(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。所述cry1A基因定性PCR反应体系为:2×GoGreenMasterMix缓冲液12.5μL,10μmol/Lcry1A-F引物1μL,10μmol/Lcry1A-R引物1μL,25ng/μLDNA模板2μL,用去离子水补至25μL。所述定性PCR反应的条件为:94℃变性5min;94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,进行35次循环;72℃延伸7min。一种cry1A基因定性PCR检测试剂盒,包括:2×GoGreenMasterMix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的序列。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:(1)序列比对:通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式,收集不同转基因作物中的cry1A基因序列,利用DNAMAN软件进行序列比对分析,并设计引物对11种转基因材料中的cry1A基因进行扩增,并测序验证。(2)引物设计:利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对分析,根据比对结果,将cry1A基因分为4类,针对4类序列中相对保守部分,利用Primerpremier5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1A基因定性PCR检测引物,cry1A-F,其核苷酸序列如序列SEQIDNo.1所示;cry1A-R,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。扩增产物大小为282bp。(3)PCR反应体系和反应程序优化:用二因子正交试验确定PCR反应体系中的引物终浓度和PCR反应程序中的退火温度。根据正交试验结果,确定最适合的PCR反应体系和反应程序。(4)方法特异性测试:选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品,对方法进行特异性测试。若仅从含有cry1A抗虫基因材料中获得预期扩增产物,而从其他样品中未获得预期扩增产物,表明方法特异性符合要求。(5)方法检出限测试:使用购买的欧盟标准物质,对含有cry1A抗虫基因的4类材料(Bt11、MON810、Bt176、DAS-81419-2)不同质量分数的样品进行测试,确定方法灵敏度。(6)本专利技术进一步提供一种cry1A抗虫基因定性PCR检测试剂盒,包括:2×GoGreenMasterMix缓冲液、引物、阳性及阴性对照样品、去离子水;所述引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的序列。本专利技术的有益效果:本专利技术的cry1A基因定性PCR检测方法具有广泛适用性,对于对cry1A基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测,该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段,为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。附图说明图1是4类Cry1A基因测序结果比对及引物结合位点图。图2是引物筛选电泳结果:M、100bp;1、Bt11;2、Bt176;3、DAS-81419-2;4、MON810;5、阴性玉米;6、空白对照。图3是PCR反应体系和反应程序优化电泳结果:3A、3B、3C、3D分别表示引物终浓度的4个梯度:0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L;1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12分别表示退火温度的5个梯度:58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。图4是方法特异性测试电泳结果:(4A)含cry1A基因材料测试结果:M、100bpDNALadder;1、Bt11;2、MON89034;3、Bt176;4、DAS-81419-2;5、C0030.3.5;6、SK12-5;7、Bt506;8、MON88017;9、MON810;10、MON531;11、MON15985;12、T304-40;13、Kefeng6;14、KMD;15、TT51-1;16、Kefeng8;17、阴性玉米;18、空白对照。(4B)不含cry1A基因材料测试结果:M、100bpDNALadder;1、空白对照;2、阴性玉米;3、阳性对照(MON810);4、MON863;5、MON88017;6、MIR604;7、TC1507;8、MIR162;9、59122;10、4114;11、MON87460;12、NK603;13、GA21;14、3272;15、T25。(4C)1、非转基因油菜混合样;2、非转基因水稻混合样;3、非转基因大豆混合样;4、非转基因玉米混合样品;5、非转基因棉花混合样品;6、阳性对照(MON810);7、空白对照。图5是利用转基因玉米Bt11对方法检出限进行测试电泳结果:(5A)欧盟标准物质:转基因玉米Bt11(质量分数分别为4.89%、1.96%、0.98%、0.49%、0.098%、<0.012%);1、4.89%;2、1.96%;3、0.98%;4、0.49%;5、0.098%;6、<0.012%;7、空白对照;(5B)转基因玉米Bt11质量分数为0.098%的样品60次重复实验结果,1-60、098%Bt11;61、阳性对照(0.98%Bt11);62、阴性玉米;63、空白对照。图6是利用转基因玉米MON810对方法检出限进行测试电泳结果:(6A)欧盟标准物质:转基因玉米MON810(质量分数分别为9.9%、1.98%、0.49%、<0.09%);1、9.9%;2、1.98%;本文档来自技高网...
用于cry1A定性分析的PCR检测引物、检测方法和检测试剂盒

【技术保护点】
一种cry1A基因定性PCR检测引物,其特征在于,所述定性检测引物为:cry1A‑F,其核苷酸序列如序列SEQ ID No.1所示;cry1A‑R,其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种cry1A基因定性PCR检测引物,其特征在于,所述定性检测引物为:cry1A-F,其核苷酸序列如序列SEQIDNo.1所示;cry1A-R,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。2.一种抗虫基因cry1A定性PCR检测方法,其特征在于,按照如下步骤进行:(1)DNA模板制备:提取待检测样品的DNA;(2)试样PCR反应:以提取样品的DNA为模板,利用cry1A基因定性PCR检测引物配置反应体系,并进行PCR扩增。(3)对照PCR反应:在试样PCR反应的同时,应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照;以非转基因玉米材料中提取的DNA作为阴性对照;以转基因玉米MON810作为阳性对照。(4)PCR产物电泳检测及凝胶成像分析。3.根据权利要求2所述的cr...

【专利技术属性】
技术研发人员:李亮董美宛煜嵩金芜军刘卫晓兰青阔温洪涛武利庆刘刚柳方方王迪
申请(专利权)人:中国农业科学院生物技术研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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