检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用制造技术

技术编号:17770617 阅读:59 留言:0更新日期:2018-04-21 23:15
本发明专利技术公开了一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用,旨在解决qRT‑PCR分析小麦全蚀病时难以实现基因表达的校正和标准化的技术问题。本发明专利技术筛选了检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因,内参基因为

【技术实现步骤摘要】
检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用
本专利技术涉及分子生物学
,具体涉及一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用。
技术介绍
小麦全蚀病是由禾顶囊壳菌小麦变种Gaeumannomycesgraminisvar.tritici引起,是一种毁灭性病害,遍及世界各小麦主产区。自1870年被命名为全烛病(Take-all)以来,中国最早于1931年在浙江省发现,60年代末开始蔓延,是我国的检疫性病害。近年来,由于作物耕作制度的变化、农机跨区作业、良种调运等原因,小麦全蚀病迅速蔓延,为害程度日趋加重。目前小麦全蚀病已扩展到西北、华北、华东等地成为小麦生产的重要病害。以河南省为例,1992年仅在原阳、浚县等地零星发生,到2012年已上升到800余万亩,遍及600多个乡镇,田块病株率高达70%,发病田块一般减产30~65%,部分麦田甚至绝收。小麦全蚀病菌正严重威胁着小麦安全生产。开展全蚀病菌的致病机理研究,分析小麦全蚀病菌侵染与基因表达过程,可对其引起的病害控制提供理论指导和实践意义。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有简单,成本较低,灵敏度高的优势,经常用来研究基因的表达分析。而荧光定量实验需要表达稳定的内参基因作为参照。内参基因是典型的组成性基因,在稳定或是侵染阶段的细胞中,内参基因能够相对稳定表达,但是在不同的实验条件下,内参基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要。因此,选择合适的内参基因是利用qRT-PCR准确分析基因相对表达量的先决条件,然而在小麦全蚀病上还未见相关内参基因的报道,难以实现基因表达的校正和标准化,大大限制了qRT-PCR在小麦全蚀病检疫检测中的应用,成为业内公认亟待解决的科研难题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物,即基于qRT-PCR的相对定量法在小麦全蚀病菌侵染小麦根部实验中对小麦全蚀病菌的功能基因进行定量分析所用的荧光定量内参基因及其引物。以及该内参基因及其引物在全蚀病菌的致病机理研究中的应用。为解决上述技术问题,本专利技术采用如下技术方案:筛选检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因,内参基因包括TUBβ、EF2-2和TUB2;其中内参基因TUBβ如序列表SEQIDNo:1中碱基序列所示,内参基因EF2-2如序列表SEQIDNo:2中碱基序列所示,内参基因TUB2如序列表SEQIDNo:3中碱基序列所示。设计检测小麦全蚀病菌根部侵染的荧光定量PCR引物,所述引物序列如序列表SEQIDNo:4~9所示,内参基因对应引物序列如下:TUBβ的特异性引物为:TUBβ-F:TCCCAACAACATCCAGACCGTUBβ-R:TCCATACCCTCGCCAGTGTAEF2-2的特异性引物为:EF2-2-F:TGTCGACCGCAACAAGATGAEF2-2-R:TTGCCCTCCTTGTCCTTGTCTUB2的特异性引物为:TUB2-F:GCCGTTTCTCGGGTCACAGTUB2-R:CAACCGTCTCATTGCTCAG设计一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的方法,包括以下步骤:(1)以上述内参基因中的至少一种做对照,引物为相应的序列;(2)选取小麦全蚀病菌根部侵染相关的预测功能基因,设计克隆引物;(3)qRT-PCR检测在感染的早期过程和增加感染后第7天后的内参基因和功能基因表达量。(4)比较内参基因和功能基因表达量的变化,判断该功能基因是否与小麦全蚀病菌根部侵染相关。与现有技术相比,本专利技术的有益技术效果在于:1.本专利技术根据长期的试验研究及经验积累,并结合理论分析和实验验证,首次从众多候选内参基因中筛选出全蚀病菌侵染小麦根部实验中表达最稳定的内参基因。2.本专利技术筛选出的内参基因是在长期技术积累的基础上,经过严格的内参筛选程序选出的,是全蚀病菌侵染小麦根部条件下表达最稳定的内参基因。3.本专利技术筛选出的内参基因适用于小麦全蚀病菌侵染小麦根部实验中小麦全蚀病菌功能基因的表达分析,能显著提高所得分析数据的准确性、可靠性,其应用广泛,操作相对简单,成本较低,灵敏度高,精确度高。附图说明图1为本专利技术所筛选10个候选内参基因引物的熔解曲线图;图2为geNorm对表达稳定性和最佳参考基因数目的分析图;图3为本专利技术所筛选10个候选内参基因的CT值表达数据图;图4为以TUBβ和GAPDH作为内参基因时PG的定量表达图。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式,但以下实施例只是用来详细说明本专利技术,并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明,均为常规仪器设备;所涉及的试剂如无特别说明,均为市售常规试剂;所涉及的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。实施例1:基因序列信息(1)序列表中SEQIDNO:1的信息序列特征长度:1834bp类型:核酸链型:双链拓扑结构:线形分子类型:DNA特性名称:TUBβ来源:小麦全蚀病菌序列描述:小麦全蚀病菌TUBβ基因全长,基因编号XM_009231745;(2)序列表中SEQIDNO:2的信息序列特征长度:3261bp类型:核酸链型:双链拓扑结构:线形分子类型:DNA特性名称:EF2-2来源:小麦全蚀病菌序列描述:小麦全蚀病菌EF2-2基因全长,基因编号XM_009220540(3)序列表中SEQIDNO:3的信息序列特征长度:1962bp类型:核酸链型:双链拓扑结构:线形分子类型:DNA特性名称:TUB2来源:小麦全蚀病菌序列描述:小麦全蚀病菌TUB2基因全长,基因编号XM_009228181。实施例2:定量实验所用植物材料小麦全蚀病菌GGT-007是河南省农业科学院植物保护研究所实验室分离自发病的小麦根部,通过菌落特征、菌丝特征以及子囊、子囊孢子的形态特征、ITS序列鉴定为小麦全蚀病菌,致病性最强的1株全蚀菌分离物(全鑫、薛保国、杨丽荣等.河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定,2014)。在PDA液体培养基中25℃、180rpm培养5天,收集菌丝用于小麦根部侵染和提取RNA。侵染用小麦为郑麦366,籽粒经75%乙醇消毒处理,用无菌水冲洗三次,表面用0.1%升汞消毒,9min,然后再用无菌水冲洗5次。种子在铺有无菌滤纸的无菌培养皿(直径12cm)中发芽培养,每皿加入5毫升无菌水。两天后,根长为2cm至3cm时,幼苗移入无菌组织培培养瓶中,5mLGgt菌丝体(为每100mLPDA液体培养基中0.1g菌丝体)浓度。所有的植物都生长在16h光照/8h黑暗交替的22℃培养箱中。取0、1、2、3、4、5、6和7天的小麦根部样,将所有的样悬于Trizol中用于RNA提取。通过此方法获得了发病稳定、且一致的侵染GGT-007的小麦根部样。实施例3:模板制备(1)总RNA提取:以RNAiso™Plus(TaKaRa,大连,中国)说明书方法提取GGT-007及其侵染根部的总RNA。取液体PDA上培养的GGT-007菌丝或GGT-007侵染的根部,液氮冷冻研磨,100mg的研磨样用于提取RNA;加入适量的RNAisoPlus(大约1ml);将匀浆室温放置5min,12000rpm,4℃离心5min;将上本文档来自技高网
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检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因及其引物和应用

【技术保护点】
一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因,其特征在于,内参基因包括

【技术特征摘要】
1.一种检测小麦全蚀病菌根部侵染的内参基因,其特征在于,内参基因包括TUBβ、EF2-2和TUB2;其中TUBβ如序列表SEQIDNo:1中碱基序列所示,EF2-2如序列表SEQIDNo:2中碱基序列所示,TUB2如序列表SEQIDNo:3中碱基序列所示。2.检测小麦全蚀病菌根部侵染的荧光定量PCR引物,其特征在于,所述引物序列如序列表SEQIDNo:4~9所示。3.一种检测...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨丽荣谢丽华全鑫张洁夏明聪孙润红薛保国武超
申请(专利权)人:河南省农业科学院植物保护研究所
类型:发明
国别省市:河南,41

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