用于快速鉴定生癌肠杆菌的特异性引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于快速鉴定生癌肠杆菌的特异性引物、试剂盒和检测方法。引物序列为YskwUP和YskwNP；试剂盒包括P C R扩增反应液、阳性对照D N A两部分；快速检测生癌肠杆菌的方法，依次包括下列步骤：（1）待检样品DNA的提取；（2）PCR扩增。本发明专利技术建立一种基于病菌在寄主上的症状特点、培养性状、生理生化特征和PCR特异性扩增的生癌肠杆菌检疫鉴定技术，可以满足口岸对来自生癌肠杆菌有发生国家和地区的杨属、桦木属、云杉属的苗木、原木、木制品和木质包装中传带的生癌肠杆菌的检测鉴定工作需要，为农林业生产、生态安全保护工作者准确检疫鉴定该病菌提供科学依据，提高该病菌检测的灵敏度性、准确性，从而保护我国农林业生产的安全与发展。

【技术实现步骤摘要】
用于快速鉴定生癌肠杆菌的特异性引物、试剂盒和检测方法
本专利技术涉及一种生癌肠杆菌PCR特异性引物和检测方法，属于微生物检测鉴定

技术介绍
生癌肠杆菌属细菌域（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），肠杆菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），肠杆菌属（Enterobacter），生癌肠杆菌（Enterobactercancerogenus）。该病病原菌能为害杨属、桦木属等木本植物，引起杨树枯萎病，具有危害严重、较难防治的特点。生癌肠杆菌是肠杆菌属(Enterobacter)细菌中唯一引起木本植物病害的四种病原菌之一。据了解到目前为止肠杆菌属已报道了33个种和5个亚种（http://www.bacterio.net），与肠杆菌科中能引起人类伤寒的伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)及能造成作物大量减产的欧文氏菌(Erwinia)相比要少得多。但是，10多年以来Enterobacterspp.作为一种新的人体条件致病菌及食品安全的潜在危险菌，越来越受到科学界的关注。然而，肠杆菌属细菌对植物致病性的研究甚少，到目前为止发现的植物上的致病菌只有7个种，包括生癌肠杆菌（E.cancerogenus），超压肠杆菌（E.nimipressuralis），坂崎肠杆菌（E.sakazakii），溶解肠杆菌（E.cloacaesubsp.dissolvens），梨形肠杆菌（E.pyrinus），阴沟肠杆菌（E.cloacae）和桑肠杆菌(E.mori)。其中四种病原体引起木本植物病害，E.cancerogenus（导致杨树溃疡），Enterobactermori（导致桑细菌性枯萎病），E.nimipressuralis（导致榆树湿心病），Enterobacterpryrinus（导致亚洲梨褐色叶枯病）。可见，肠杆菌属中只有生癌肠杆菌能够引起杨树发病。生癌肠杆菌于1966年被Uroŝević首次报道，并被命名为Erwiniacancerogena。随后FarmerJJ等于1985年将其改名为Enterobactertaylorae，最终DickeyRS等于1988年将其改名为Enterobactercancerogenus，并一直沿用至今。该菌一方面经常在临床上被报道，认为是一种人体机会性致病病原；一方面，该菌也能引起一些植物病害，Uroŝević于1966年首次报道该菌能引起杨树发生溃疡，在特定条件下能够引起严重的杨树枯萎病症状。杨树枯萎病产生的病害症状随树木品种的感病性和天气条件而发生变化。通常情况下该病菌可导致坏死，引起树皮下组织显著生长，伴随着明显的树皮开裂，还可引起云杉等树枝顶端坏死。侵染后茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。感病品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且纵向排列。可观察树皮、树枝是否有溃疡斑或者开裂现象，树枝顶端是否产生坏死来判断是否发生杨树枯萎病。杨树枯萎病最早于1966年在捷克斯洛伐克首次报道，现已蔓延扩散到波兰，在一些中年林中引起严重问题。生癌肠杆菌的寄主杨属、桦属等树种均是与生态环境和人民经济生活密切相关的树种，病菌一旦从国外传入，由于没有相应的天敌和防治措施，将会大规模扩散，对相关产业造成不可估量的损失。因此，目前生癌肠杆菌被列为2007版《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中检疫对象之一。杨树(Populusspp.)在我国分布广泛、种类繁多，与生态环境和人民经济生活密切相关，也是建立速生丰产林的主要树种。世界上天然杨树约100多种，而我国约有62种（包括6杂交种）。我国正处于世界杨树中心分布区区域内，所以我国杨树种类多，分布面积广，遍及22个省(区、市)。我国杨树林总面积达1000多万hm2(包括3年生以下幼龄树)，总蓄积量为42596.5万m3。全国杨树人工林面积为700多万hm2(包括3年生以下幼龄树)，约占我国人工林总面积的19%。其中用材林面积为309万hm2，约占杨树人工林面积的40%。杨树人工林分布区，北由北纬49°的松嫩平原北界，南到28°附近的两湖平原，东由沿海岛屿滩涂，西至新疆西部边界，这个分布范围的面积约占我国国土的2/5。由于杨树品种、类型繁多，分布广泛，生长快，繁殖易，我国集中连片，大面积栽植于用材林、防护林、水土保持林、农田林网和四旁绿化。但是由于杨树在生长过程中不仅直接受到各类病原物的侵害，各种立地条件和环境因素的影响诱发疾病，而且在栽培过程中品种选择不当，或扩大了适宜栽培的地理范围，或栽培技术措施不力，使得杨树不能健壮生长，有的形成“小老树”，不能抵御各种病原物的侵袭，造成严重危害，引起较大的经济损失。据相关文献统计，98种(包括品种、无性系、栽培种)杨树上的生物病原物共有246种，其中真菌205种(子囊菌门38种、担子菌门99种、有丝分裂孢子真菌68种)、细菌12种、病毒1种、线虫11种、螨类6种、寄生性种子植物11种。当然长发病和多见病在我国也仅20种左右。杨树是一种非常敏感的适地适树树种，每一品种都有它的适生范围，无原则地扩大适宜栽培的地理范围，扩大了某些杨树品种或无性系的优良特性，不顾立地条件盲目引进种植，其结果造成生长不良、诱发多种病害，导致失败。目前，针对生癌肠杆菌的快速检疫鉴定还没有方法也没有相应的国家标准、行业标准。国内外针对生癌肠杆菌的检测没有采用分子生物学方法（如PCR-凝胶电泳、实时荧光PCR等）的检测方法报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种生癌肠杆菌PCR特异性引物、试剂盒和检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术设计了一组生癌肠杆菌PCR特异性引物，引物序列如下：YskwUP：5’-gcgttctttgtttgactgaatggtg-3’。YskwNP：5’-atcgtcgatctcgcttgcggata-3’。本专利技术还提供一种快速检测生癌肠杆菌的试剂盒，包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两部分：PCR扩增反应液总体积为25μL，其中含：2μL的样品DNA10μg/mL-100μg/mL，10μM上下游引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μl，10μmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水补足至总体积25μL。涉及的PCR扩增检测用的引物序列如下：YskwUP：5’-GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTG-3’。YskwNP：5’-ATCGTCGATCTCGCTTGCGGATA-3’。阳性对照DNA为含有生癌肠杆菌的DNA提取液。利用上述的引物，本专利技术提供一种快速检测生癌肠杆菌的方法，依次包括下列步骤：（1）待检样品DNA的提取采用改良的CTAB法或适用的商品化试剂盒进行DNA提取（2）PCR扩增A.采用25μLPCR反应体系：PCRPremix12.5μL，H2O8.5μL，10μM引物各1μL，DNA模板2.0μL。PCRPremix里面包括的成分：0.1UTaqpolymerase/μL，500μMDNTPeach，20mMTris-HCL(本文档来自技高网...

【技术保护点】
生癌肠杆菌PCR特异性检测引物，其特征在于，引物序列如下：YskwUP ：5’‑GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTG‑3’；YskwNP ：5’‑ATCGTCGATCTCGCTTGCGGATA‑3’。

【技术特征摘要】
1.生癌肠杆菌PCR特异性检测引物，其特征在于，引物序列如下：YskwUP：5’-GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTG-3’；YskwNP：5’-ATCGTCGATCTCGCTTGCGGATA-3’。2.快速检测生癌肠杆菌的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两部分：PCR扩增反应液总体积为25μL，其中含：2μL的样品DNA10μg/mL-100μg/mL，10μM上下游引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μl，10μmol/LdNTP2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水补足至总体积25μL；涉及的PCR扩增检测用的引物序列如下：YskwUP：5’-GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTG-3’；YskwNP：5’-ATCGTCGATCTCGCTTGCGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：厉艳，李金庆，邵秀玲，封立平，段效辉，王英超，赵丽青，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37