用于乳酸菌测序的扩增引物对、乳酸菌种属鉴定方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，所述引物对为Lab‑6，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Lab‑6F和SEQ ID NO.2所示的Lab‑6R。该扩增引物对可以实现乳酸菌种属鉴定，具有较好的特异性和实用性，能较好反映肠道中乳酸菌的多样性。适用于发酵乳制品、粪便和土壤等复杂样品中乳酸菌的分析。

【技术实现步骤摘要】
用于乳酸菌测序的扩增引物对、乳酸菌种属鉴定方法及应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对、乳酸菌种属鉴定方法及应用。这种鉴定方法可以对粪便等复杂样品中乳酸菌进行测序。这对引物序列是基于乳酸菌(主要包含乳酸杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、肠球菌属、明串球菌属、链球菌属和片球菌属)16SrRNA基因序列设计的，其PCR扩增产物达750bp左右，满足测序要求。
技术介绍
乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)是发酵碳水化合物生产乳酸、无芽孢、不运动或很少运动、过氧化氢酶呈阴性的革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌分布广泛，在人类胃肠道生态系统中发挥有益作用。乳酸菌可以通过几种抗菌机制防止肠粘膜病原体的粘连和复制，还可以在肠腔释放各种酶，对消化作用产生协同作用和缓解肠道不良反应的症状。食用LAB发酵乳制品还可能会起到抗肿瘤的作用。因此，乳酸菌具有改善肠道环境和维护肠道菌群平衡的作用。同时，许多研究发现，乳酸菌在粪便中的存在，其含量往往与宿主健康有紧密联系。Schiffrin等人发现，健康志愿者连续食用益生菌发酵制品3周，其外周血细胞的非特异性吞噬活性增强，其粪便中的双歧杆菌属和乳酸杆菌属的数量明显增加，停用益生菌3周后的粪便菌落即刻恢复到最初时刻，吞噬活动的增加开始减少(SchiffrinEJ,BrassartD,ServinAL,etal.Immunemodulationofbloodleukocytesinhumansbylacticacidbacteria:criteriaforstrainselection.[J].AmericanJournalofClinicalNutrition,1997,66(2):515S.)。Zheng等人以50名患湿疹的婴儿与51名健康婴儿为研究对象，利用高通量测序技术对婴儿粪便中细菌组成进行研究，发现在健康婴儿组有4个属含量丰富，其中包括链球菌属，尤其是已知具有抗炎性的Streptococcussalivarius，在健康的婴儿粪便中含量很高，在患有湿疹的婴儿体内含量很低。而且，乳酸杆菌属的含量在健康婴儿体内高于湿疹婴儿的，但是无法鉴定到具体种(ZhengH,LiangH,WangY,etal.AlteredGutMicrobiotaCompositionAssociatedwithEczemainInfants[J].PlosOne,2016,11(11):e0166026.)。肠道中有数以万计的微生物，采用传统技术可以从粪便中获取部分可培养和相对含量较高的微生物，但很难从中获取曾经存活或是难以分离的部分微生物。随着高通量测序技术的迅速发展，纯培养技术遇到的这些障碍逐渐被克服，使得全面研究肠道微生物多样性成为可能。但是肠道中乳酸菌的相对含量较低，目前用来研究肠道菌群多样性的细菌通用引物无法扩增出肠道中的乳酸菌进行测序，这使肠道中乳酸菌的群落结构及其在人群肠道的分布和多样性研究受到阻碍。深入解析人体肠道中乳酸菌的群落结构及多样性，不仅有助于研究乳酸菌在肠道中的分布及多样性，还有助于研究肠道中乳酸菌与各种疾病的关系，为调节肠道菌群提供科学理论依据。目前已有的乳酸菌引物多用于乳酸菌的鉴定和定量，扩增片段多集中在200-400bp，而且最多可以扩增出4个乳酸菌属，这不但无法满足高通量测序及鉴定的要求，而且不利于肠道中的乳酸菌群落结构的全面研究。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供一种用于肠道中乳酸菌测序的方法及其所用引物序列，弥补了细菌通用引物不能全面扩增肠道中乳酸菌的缺陷，为研究肠道中乳酸菌与人类健康关系奠定了基础。本专利技术的第一个目的是提供一种用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，所述引物对为Lab-6，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Lab-6F和SEQIDNO.2所示的Lab-6R：Lab-6F：5’-GCTCAGGAYGAACGCYGG-3’，其中，Y表示C或T；Lab-6R：5’-CACCGCTACACATGRADTTC-3’，其中，R表示A或G，D表示A或G或T。本专利技术的第二个目的是提供利用上述扩增引物对鉴定乳酸菌种属的方法，包括如下步骤：S1：提取含有乳酸菌的待测样品的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以Lab-6F和Lab-6R为扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S2：序列测定将PCR扩增产物纯化后，得到大小750bp的扩增片段，对目标扩增片段进行SMRT高通量测序；S3：使用QIIME(V1.7)平台对扩增序列进行物种注释，得到准确的鉴定结果。优选地，所述乳酸菌包括乳酸杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、肠球菌属、明串球菌属、链球菌属和片球菌属。优选地，S2中，PCR扩增体系为：PCR扩增反应程序为：本专利技术的第三个目的是提供上述用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对在制备肠道中乳酸菌检测试剂盒中的应用。本专利技术的第四个目的是提供上述用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对在发酵乳制品、粪便或土壤样品中乳酸菌种属分析的应用。本专利技术提供的用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物是基于乳酸菌16SrRNA基因序列设计的，可以扩增出多个乳酸菌属，具有较好的特异性和实用性，能较好反映肠道中乳酸菌的多样性。同时适用于发酵乳制品、粪便和土壤等样品中乳酸菌的分析。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1中14个待测材料的乳酸菌引物Lab-6特异性扩增结果；图中，从左到右分别依次为Marker、Enterococcusasini(DSM-11492)、Enterococcusfaecium(ATCC19434T)、EnterococcusItalicus(DSM-15952)、LactobacillusCasei(ATCC-334)、LactobacillusSalivarius(DSM-20555)、LactobacillusHelveticus(1.2278)，WeissellaBeninensis(DSM-22752)、Weissellacofusa(IMAU10245)、Weissellakandleri(DSM-20593)、PedicoccusAcidilactici(JCM8791)、PedicoccusPentosaceus(DSM-20336)、Leuconostocpsedomesenteroides(DSM-20193)、StreptococcusThermonphillus(NM-81-2)、Lactococcusplantarum(DSM-20686)、灭菌蒸馏水。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案能予以实施，下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供的用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，其特征在于，所述引物对为Lab‑6，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Lab‑6F和SEQ ID NO.2所示的Lab‑6R：Lab‑6F：5’‑GCTCAGGAYGAACGCYGG‑3’，其中，Y表示C或T；Lab‑6R：5’‑CACCGCTACACATGRADTTC‑3’，其中，R表示A或G，D表示A或G或T。

【技术特征摘要】
1.一种用于肠道中乳酸菌测序的扩增引物对，其特征在于，所述引物对为Lab-6，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Lab-6F和SEQIDNO.2所示的Lab-6R：Lab-6F：5’-GCTCAGGAYGAACGCYGG-3’，其中，Y表示C或T；Lab-6R：5’-CACCGCTACACATGRADTTC-3’，其中，R表示A或G，D表示A或G或T。2.一种利用权利要求1所述扩增引物对鉴定乳酸菌种属的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：提取含有乳酸菌的待测样品的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以Lab-6F和Lab-6R为扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S2：序列测定将PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟智，孙志宏，张和平，白晓晔，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15