泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法技术

本发明专利技术公开了一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。该泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，该试剂盒的使用方法快速简便，并且特异性好，对非沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的病原体微生物不会检测出，因而不易出现假阳性的问题，并且灵敏度高，可达400copies/ml，检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测范围宽。

【技术实现步骤摘要】
泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
本专利技术涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
技术介绍
泌尿生殖道微生物的研究具有重要的临床和科研价值。泌尿生殖道微生物种类繁多，常见的有沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)及淋球菌(NG)等。沙眼衣原体是一种具有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，是一类介于病毒、细菌和立克次体之间的特殊微生物，在微生物分类上属于细菌门、立克次体纲、衣原体目、衣原体属。沙眼衣原体是国内外最常见的泌尿生殖道感染型微生物，在我国生殖道衣原体感染居STD的第三位，且其发病率有逐年增高的趋势。机体感染沙眼衣原体后，能诱导产生特异性细胞免疫和体液免疫，但通常免疫力不强，且维持短暂，因而常造成持续感染、隐性感染和反复感染。解脲脲原体又称解脲支原体，属于柔膜纲支原体目支原体科的脲原体属，是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，主要分布于人体泌尿生殖道内，并可通过性接触而传播，也可由母体垂直传染给胎儿。男性生殖道最常见的寄生处在尿道口和精液中，女性生殖道最常见的寄生处在阴道。解脲脲原体是非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，感染后可导致多种生殖道炎症。在男性，可导致非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎等的发生；在女性可引起包括子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等，宫内感染可引起流产、死胎、早产等不良后果。奈瑟淋球菌在1879年由Neisser发现，俗称淋病双球菌或淋球菌，是引起人类淋病的致病病原体，属奈瑟菌属。淋球菌有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是发展中国家发病率较高的性传播疾病之一。淋球菌主要通过性接触直接感染，也可以通过接触患者的衣物或马桶等间接感染，还可以通过产道感染分娩时的胎儿。目前沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的实验室检测方法主要有分离培养法、免疫学方法、基于核酸检测的分子生物方法等。培养法的特异性和敏感性高，但其具有临床检测时间过长(至少需要24h～48h，甚至更长时间)，过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响等缺陷，不适用于大范围检测。免疫学方法简便快捷，但特异性差、灵敏度不高。近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能动态反应病原体变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。目前已有一些基于实时荧光定量PCR技术检测沙眼衣原体、解脲脲原体或淋球菌DNA的试剂盒产品，但普遍存在特异性差、灵敏度低的问题，并且大部分是针对沙眼衣原体、解脲脲原体或淋球菌单一的检测试剂盒，对于多种病原体微生物混合的检测效果尤其差，并且处理过程繁琐。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种检测特异性好、灵敏度高的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针；所述沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:3所示；所述解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:6所示；所述淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:9所示；各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。在其中一个实施例中，所述沙眼衣原体的检测探针上标记的荧光报告基团是HEX或VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述解脲脲原体的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述淋球菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，包括上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针。在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括内标阳性质控及其扩增引物对和检测探针；所述内标阳性质控含有序列如SEQIDNO:13所示的β球蛋白目的基因片段；所述内标阳性质控扩增引物对的两条引物的序列分别SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:12所示；所述内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且其标记的荧光报告基团不同于所述泌尿生殖道微生物的检测探针上标记的荧光报告基团。在其中一个实施例中，所述内标阳性质控的检测探针上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ2。在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒包括灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌阳性对照品。在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs试剂中的至少一种。在其中一个实施例中，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP，所述试剂盒中还包括UNG酶。一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；以提取的核酸样本作为模板，加入上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针进行实时荧光PCR扩增反应；在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法还包括使用上述内标阳性质控和/或上述阳性对照品进行与待测样本同样处理的步骤。上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，该试剂盒的使用方法快速简便，并且特异性好，对非沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的病原体微生物不会检测出，因而不易出现假阳性的问题，并且灵敏度高，可达400copies/ml，检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测范围宽。进一步，该试剂盒和试剂盒的使用方法通过对PCR反应体系进行优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。更进一步，通过增加内标阳性对照，通过检测人表皮细胞中的β-球蛋白来评定采集的样本是否适用于扩增反应，可以监测待测样本中是否具有PCR抑制物，因而可以评价核酸提取的质量，避免PCR假阴性的问题。在实时荧光PCR扩增过程中，通过实时荧光采集，在PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值可以很容易判断沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌DNA的阴、阳性，检测结果可用于沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，从而为沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的研究提供可靠的实验依据。附图说明图1～图3依次为沙眼衣原体、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，其特征在于，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针；所述沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示；所述解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示；所述淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示；各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。

【技术特征摘要】
1.一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，其特征在于，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针；所述沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:3所示；所述解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:6所示；所述淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQIDNO:9所示；各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。2.如权利要求1所述的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，其特征在于，所述沙眼衣原体的检测探针上标记的荧光报告基团是HEX或VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述解脲脲原体的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述淋球菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。3.一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针。4.如权利要求3所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，还包括内标阳性质控及其扩增引物对和检测探针；所述内标阳性质控含有序列如SEQIDNO:13所示的β球蛋白目的基因片段；所述内标阳性质控扩增引物对...

【专利技术属性】
技术研发人员：李勃，杨帮林，刘保生，邓中平，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43