本发明专利技术公开了一种用于检测临床血培养瓶中常见病原菌的方法。该方法基于多重聚合酶链式反应技术，包括血培养瓶中细菌基因组DNA提取、PCR扩增、电泳凝胶紫外成像等步骤。基于该方法所制备的产品，可以实现十种细菌同时检测，较测序、数字PCR等技术操作更简便、成本更低、且有较高的灵敏度和特异性。应用该产品，可以极大的缩短临床细菌检测鉴定周期，提高细菌检出效率和准确性。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测血培养瓶中临床常见病原菌的产品和方法
本专利技术属于微生物检测领域，涉及一种用于检测血培养瓶中多种临床常见病原菌的引物系统及其产品和方法，对临床微生物进行快速、准确鉴定。
技术介绍
血流感染是指病原菌与其毒素侵入血流引起的感染。主要临床表现为:骤发寒战，高热，心动过速，呼吸急促，皮疹，肝脾肿大和精神，神志改变等一系列严重临床症状，严重者可引起休克，弥散性血管内凝血(DIC)和多脏器功能衰竭。病原微生物因其繁殖力强、侵蚀性高、变异快的特点，极易造成疾病的大流行，因此实现快速灵敏的分析鉴定,是控制传染病的首要选择。研究调查表明，血流感染和医院感染菌株中，革兰阴性菌和革兰阳性菌占有大部分的比例，其次是一些真菌感染，占有小部分的比例。在这些病原菌中，大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌占绝大多数，近些年来，肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌感染的比例也在逐年上升，另外细菌感染的一小部分还有肠球菌，铜绿假单胞菌，肺炎链球菌，变形杆菌的感染。针对目前临床细菌感染状况，现在自动化的血培养系统已在临床微生物实验室中广泛使用，通常情况下，当出现阳性报警瓶时，先将瓶中的菌液转种于血平板，然后做鉴定和药敏试验，最终结果获得是在阳性瓶报警后的48-72h，不能满足临床细菌快速检测需求，对抗感染治疗十分不利。综上所述，血培养的方法阳性率低，耗时长，操作复杂，不能满足临床大规模细菌快速检测。目前很多检测技术应用于细菌检测，但是存在着局限性。例如气相色谱与高效液相色谱仪技术检测病原菌，气相色谱的应用较多，利用气相色谱仪分析微生物的代谢产物，如各种挥发性和非挥发性脂肪酸或其他成分，有助于鉴别各种专性厌氧菌、铜绿假单胞菌等。气相色谱仪可直接检查临床标本，快速诊断厌氧菌高效液相色谱仪可用于分析分枝菌酸和糖类。将裂解法和气相色谱法结合，比较裂解气相色谱峰，可用以鉴定肠杆菌属、葡萄球菌属等。但其技术的局限在于灵敏度低，操作复杂，成本昂贵。基因芯片技术是一种高通量技术，可用于微生物检测。目前基因芯片较多地应用于基因表达分析上，用于临床诊断的基因芯片研究并不多见。原因是微生物种类多种多样，很难建立一种通用的手段来对多种微生物进行分析。研究证实用基因芯片法检测败血症病原菌的阳性率明显高于血培养。基因芯片技术本身有一些关键问题亟待解决如(1)基因芯片的特异性的提高；样品制备和标记操作的简化；(3)增加信号检测的灵敏度；(4)高度集成化样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发。制约基因芯片技术发展及应用的最主要的因素是这种技术的成本较为昂贵，目前只有制药公司和少数研究所才能承受。新的病原菌微生物的不断出现和病原微生物耐药机制的复杂性也是芯片技术要解决的问题。上述问题不仅是当前和今后一段时期内国内外基因芯片技术研究的焦点，同时也是基因芯片能否从实验室研究推向临床应用的关键问题。二代测序技术筛检病原体的优势在于①不依赖于病原体的培养；②已经死亡的细菌、使用抗生素的细菌都可以检出；③可同时检出病原体的型别、独立基因和耐药基因；④结果准确可靠，碱基序列没有模糊信号，不像EUSA、PCR、杂交芯片等；⑤通量极大；⑥既可以发现已知病原体、又可以发现完全未知的病原体。但其技术局限性在于操作复杂，成本高，无法满足临床大规模细菌检测。相比较上述技术，多重PCR技术具有特异、灵敏和快捷的特点，能同时进行多种病原微生物的鉴定，对于流行病的检测与预防，具有不可替代的作用。自1988年首次报道了采用多重PCR技术诊断异基因脐带血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症(DMD)以来，多重PCR方法已被广泛用于对多个目的基因的同时检测，多重PCR技术是在同一反应管里加入多对引物，能够同时、快速检测多个基因片段。因此，多重PCR既可以用于科学研究又能符合临床常规检测需求。多重PCR技术以其高效灵敏、准确快速、操作简便、成本低廉的特点被广泛应用于病原菌的检测。
技术实现思路
本专利技术原理在于：提供了一种联合了DNA提取技术、多重PCR技术、电泳紫外成像技术同时检测多种临床常见病原菌的检测方案，优选同时检测10种病原菌。其中：DNA提取技术采取盐酸胍-苯甲醇手工提取法，在两个反应管中分别加入多对不同细菌的特异性引物(优选各加入5对引物)，进行多重PCR扩增，得到对应的细菌扩增片段，进行电泳凝胶成像，从而鉴定细菌菌种。本专利技术第一个目的在于提供一种检测10种细菌特异性序列的PCR引物系统或引物组，其序列如表1所示。表1同时提供一种用于检测病原菌的PCR引物系统，所述PCR引物系统包含选自如下组的引物：1)扩增肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)特异性序列的引物SEQIDNo：1和SEQIDNo：2；2)扩增鲍曼不动杆菌(A.baumannii)特异性序列的引物SEQIDNo：3和SEQIDNo：4；3)扩增屎肠球菌(E.faecium)特异性序列的引物SEQIDNo：5和SEQIDNo：6；4)扩增肺炎链球菌(S.pneumonia)特异性序列的引物SEQIDNo：7和SEQIDNo：8；5)扩增粪肠球菌(E.faecalis)特异性序列的引物SEQIDNo：9和SEQIDNo：10；6)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQIDNo：11和SEQIDNo：12；7)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQIDNo：13和SEQIDNo：14；8)扩增变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQIDNo：15和SEQIDNo：16；9)扩增表皮葡萄球菌(S.epidermidis)特异性序列的引物SEQIDNo：17和SEQIDNo：18；和/或10)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQIDNo：19和SEQIDNo：20。本专利技术所述“病原菌”可来源于生物样本或非生物样本，生物样本例如离体病灶组织，患者血液等，非生物样本例如食物，水源，空气，土壤等等。本专利技术所述“检测病原菌”或“病原菌检测”即可以是疾病/健康状况诊断或治疗目的的病原菌检测，也可以是非诊断或治疗目的的病原菌检测，例如环境监测，食物安全监测等。上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'端加入10bp的tag(ACGTTGGATG)。例如，PCR引物SEQIDNo：1的5'端加入10bp的tag为5'-ACGTTGGATGGACGATGCTACTTATCC-3’。本专利技术第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于检测多种临床常见病原菌的检测产品。在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：(1)用于提取细菌基因组DNA的试剂，优选来自于血培养瓶中的细菌；(2)用于PCR的反应试剂，包括：细菌特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反应缓冲液；(3)用于电泳紫外成像的凝胶试剂。在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品等试剂。本专利技术第三个目的是提供一种使用上述引物、产品或试剂盒来检测多种临床常见病原菌的方法，包括如下步骤：(1)细菌基因组DNA的提取：采用盐酸胍-苯甲醇方法提取血培养瓶中的细菌DNA。(2)多重PCR：使用特异性的P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测病原菌的PCR引物系统，其特征在于，所述PCR引物系统包含选自如下组的引物：1)扩增肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；2)扩增鲍曼不动杆菌(A.baumannii)特异性序列的引物SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；3)扩增屎肠球菌(E.faecium)特异性序列的引物SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；4)扩增肺炎链球菌(S.pneumonia)特异性序列的引物SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；5)扩增粪肠球菌(E.faecalis)特异性序列的引物SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；6)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；7)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；8)扩增变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；9)扩增表皮葡萄球菌(S.epidermidis)特异性序列的引物SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；和/或10)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQ ID No：19和SEQ ID No：20。...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测病原菌的PCR引物系统，其特征在于，所述PCR引物系统包含选自如下组的引物：1)扩增肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)特异性序列的引物SEQIDNo：1和SEQIDNo：2；2)扩增鲍曼不动杆菌(A.baumannii)特异性序列的引物SEQIDNo：3和SEQIDNo：4；3)扩增屎肠球菌(E.faecium)特异性序列的引物SEQIDNo：5和SEQIDNo：6；4)扩增肺炎链球菌(S.pneumonia)特异性序列的引物SEQIDNo：7和SEQIDNo：8；5)扩增粪肠球菌(E.faecalis)特异性序列的引物SEQIDNo：9和SEQIDNo：10；6)扩增大肠埃希菌(E.coli)特异性序列的引物SEQIDNo：11和SEQIDNo：12；7)扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性序列的引物SEQIDNo：13和SEQIDNo：14；8)扩增变形杆菌(P.mirabilis)特异性序列的引物SEQIDNo：15和SEQIDNo：16；9)扩增表皮葡萄球菌(S.epidermidis)特异性序列的引物SEQIDNo：17和SEQIDNo：18；和/或10)扩增铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性序列的引物SEQIDNo：19和SEQIDNo：20。2.一种检测10种细菌特异性序列的PCR引物系统，其特征在于，所述PCR引物系统包含SEQIDNo：1-SEQIDNo：20所示引物。3.根据权利要求1或2所述的PCR引物系统，其特征在于，引物5'端可包括5-15个保护碱基，所述保护碱基序列优选为10bp的tag：ACGTTGGATG。4.由权利要求1-3任一项所述的PCR引物系统制备的用于检...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成彬，陈琛，何赏，胡翀，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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