一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法技术

技术编号:17770595 阅读:54 留言:0更新日期:2018-04-21 23:14
本发明专利技术属于基因工程技术领域,公开了一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法,采用核桃黑斑病菌X.campestris pv.实时荧光PCR特异性检测体系扩增核桃黑斑病菌X.campestris pv.的特异性基因序列,利用

【技术实现步骤摘要】
一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法
本专利技术属于基因工程
,尤其涉及一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是1985年开始出现的一项体外扩增核酸片段的基因检测技术,由于PCR技术简单易行、灵敏度高等优点,在临床研究和动植物病原菌检测等方面广泛应用,成为分子生物学必不可少的工具。但普通PCR反应结果需要进行凝胶电泳分析,不能实时监测;且在许多情况下,只得知某一特异DNA序列是否存在,已经不能完全满足研究和实际工作的需要,因而,借助PCR技术对基因进行快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。实时荧光定量PCR(rel-timequantitationpolymerasechainreaction,Real-timePCR)技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,还以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应、可实时监测等优点成为了分子生物研究中的重要工具,目前已得到广发应用。近年来,黑斑病(Walnutblight)在多地连年发生,且分布广泛,影响核桃产业的健康发展。传统核桃细菌性黑斑病的诊断鉴定是依据症状和病原菌培养特征作出判断,然而症状判断易导致错判,且病原菌分离培养操作繁琐、还需较长生长周期,往往影响及时准确的防治。所以急需找到一种能快速、准确、高效的分子生物学检测方法以实现对处于潜育期的病害进行早期诊断,以便及时做好预防和控制,为核桃黑斑病的早期防治提供技术支持。综上所述,现有技术存在的问题是:传统的病原菌检测方法往往不够准确、操作繁琐且需要较长周期,影响及时准确的防治。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题,本专利技术提供了一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法。由于近年来国内外研究者广泛将PCR技术应用于对植物病原菌的检测,但到目前为止,国内外对核桃黑斑病的研究主要集中在其发病规律和防治措施等方面,未出现用PCR特异性检测引物对其进行特异性扩增的相关研究。故本专利技术是这样实现的,设计一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物的序列为:SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物建立的核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系为:PremixExTaqⅡ5.0μL;上游引物0.2μL;下游引物0.2μL;cDNA0.5μL;RNaseFreeH2O4.1μL。进一步,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数为:95℃预变性3min;95℃变性10s,59.0℃退火30s,72℃延伸30s;40个循环;95℃10s;以0.5℃/5s的速率从65℃升温至95℃绘制溶解曲线。本专利技术的另一目的在于提供一种所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物建立的核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测方法,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测方法包括以下步骤:步骤一,采用核桃黑斑病菌X.campestrispv.实时荧光PCR特异性检测体系扩增核桃黑斑病菌X.campestrispv.的特异性基因序列,利用PremixExTaqⅡ与双链DNA结合后发出荧光的特性,检测反应体系中的PremixExTaqⅡ与DNA结合后发出的荧光,检测PCR产物扩增量;步骤二,通过设计核桃黑斑病菌X.campestrispv.的特异性引物,引发特异性扩增,通过荧光信号的收集处理,获得特异性扩增曲线。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物检测核桃黑斑病菌。本专利技术可检测出来自植物组织样本的微量cDNA(RNA),完全区分核桃黑斑病菌X.campestrispv.与核桃植物上存在的其他细菌,检测灵敏度高,方法快捷,易操作。本专利技术具有很好的重复性,每次对疑似核桃黑斑病组织进行检测时,不需要进行繁琐的病原菌分离培养,也不需要等待超过一周的病原菌生长周期,只需按照总RNA提取试剂盒提取出待测组织总RNA,参照TaKaRa反转录试剂盒将其反转录成cDNA,用细菌通用引物细菌通用引物27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)对其进行普通PCR扩增验证cDNA质量后,便可进行实时荧光PCR扩增,反应体系为:PremixExTaqⅡ5.0μL;上游引物0.2μL;下游引物0.2μL;cDNA0.5μL;RNaseFreeH2O4.1μL。反应参数为:95℃预变性3min;95℃变性10s,59.0℃退火30s,72℃延伸30s;40个循环;95℃10s;以0.5℃/5s的速率从65℃升温至95℃绘制溶解曲线。当实时荧光PCR扩增结束时,若其cDNA在30个循环以内产生了特异性扩增曲线,即表明该组织含有核桃黑斑病菌X.campestrispv.,其为核桃黑斑病组织;若其cDNA在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线,则该组织不含核桃黑斑病菌X.campestrispv.,不是核桃黑斑病组织。采用本专利技术检测核桃黑斑病病部组织结果显示,采用核桃黑斑病菌X.campestrispv.的特异性引物进行的荧光PCR扩增,会产生一条特异性扩增曲线,即经过实时荧光PCR分析,即可对核桃黑斑病菌X.campestrispv.进行准确鉴定,具有很好的特异性,且全部检测步骤最快可在6小时之内完成,对核桃黑斑病的早期防治具有重大意义。附图说明图1是本专利技术实施例提供的核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的菌种鉴定及序列比对示意图。图3是本专利技术实施例提供的引物的特异性分析,引物PCR扩增的电泳检测结果示意图;图中:M为DL2000marker;CK空白对照为RNaseFreeH2O;1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌X.campestrispv;6-7为分离自核桃植株附近土壤的细菌,8-23为分离自不同地区的核桃植株上的其他细菌。图4是本专利技术实施例提供的核桃黑斑病菌X.campestrispv.实时荧光PCR的溶解曲线检测结果示意图;图中:1-5为1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌X.campestrispv.;CK空白对照为RNaseFreeH2O。图5是本专利技术实施例提供的核桃黑斑病菌X.campestrispv.与其他核桃植株相关细菌的实时荧光PCR特异性检测结果示意图;图中:1-5为分离自不同地区的核桃黑斑病菌X.campestrispv;6-23为分离自不同地区的核桃植株上的其他细菌及分离自核桃植株附近土壤的细菌;CK空白对照为RNaseFreeH2O。图6是本专利技术实施例提供的灵敏度分析结果示意图;图中:1-8分别对应以7.0μg/ml、7.0×10-1μg/ml、7.0×10-2μg/ml、7.0×10-3μg/ml、7.0×10-4μg/ml、7.0×10-5μg/ml、7.0×10-6μg/ml、7.0×10-7μg/ml8个浓度的cDNA模板分别进本文档来自技高网
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一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物及方法

【技术保护点】
一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物,其特征在于,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物的序列为:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物,其特征在于,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物的序列为:SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。2.一种利用权利要求1所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测引物建立的核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系,其特征在于,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系为:PremixExTaqⅡ5.0μL;上游引物0.2μL;下游引物0.2μL;cDNA0.5μL;RNaseFreeH2O4.1μL。3.如权利要求2所述的的核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系,其特征在于,所述核桃黑斑病菌实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数为:95℃预变性3min;95℃变性10s,59.0℃退火30s,72℃延伸30s;40个循环;95℃10s;以0.5℃/5s的速率...

【专利技术属性】
技术研发人员:朱天辉谢玲李姝江朱涵明月谯天敏韩珊
申请(专利权)人:四川农业大学
类型:发明
国别省市:四川,51

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