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一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法技术

技术编号:17770579 阅读:61 留言:0更新日期:2018-04-21 23:13
本发明专利技术涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法,属于中药鉴定技术领域;本发明专利技术将僵蚕样品粉碎后采用CTAB法同时提取家蚕和菌物中的DNA,并以此为模板,选用经设计与筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增,继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测,最终依据检测结果判别僵蚕的真伪和掺伪情况;通过本发明专利技术的方法判断样品是否为僵蚕伪品或掺伪品,操作简单、无需测序、专属性强、快速准确,在僵蚕样品真伪鉴定中具有独特的优势及重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法
本专利技术涉及一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法,属于中药鉴定领域。
技术介绍
僵蚕,为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriLinnaeus4~5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥体。多于春、秋季生产,将感染白僵菌病死的蚕干燥。僵蚕始载于《神农本草经》,应用历史悠久,咸、辛,平,归肝、肺、胃经,具有息风止痉、祛风止痛和化痰散结等功效。现代药理研究表明,僵蚕具有抗凝、抗惊厥、抗癌和镇静催眠等作用。僵蚕是常见的中药动物药,疗效确实、药用价值高,年需求量在400吨以上,且常年外销出口。由于僵蚕的使用量较大,市面上出现了不少伪品或掺伪品,例如用石灰水将死家蚕掺白加工而成,或将绿僵菌感染致死的家蚕、黑死蚕等冒充正品使用,对僵蚕质量造成了不良影响,也给消费者带来了不可忽视的安全隐患。因此,采用合适的技术鉴别僵蚕的真伪是很关键的问题。近年来,有学者运用分子生物学技术开展了对僵蚕的鉴定研究,例如基于COI序列和ITS序列的DNA条形码技术,主要利用动物基因组DNA提取试剂盒同时提取家蚕和白僵菌的DNA,然后分别扩增COI序列和ITS序列,并进行扩增产物测序,继而建立NJ类聚树分析,对鉴定同时含有动物和真菌的复合型药材起到了一定效果。但是,在普通PCR技术利用DNA序列进行物种的鉴定过程中,由于采用了通用引物,因此在完成扩增后,需要进行产物测序并与基因数据库比对,从而判断种属,步骤较多、耗时长、需要专门设备;此外,还无法实现对于掺伪品的检识,或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的问题,本专利技术针对僵蚕正品以及常见伪品的物种设计特异性引物,并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别僵蚕的方法。该法操作简单、专属性强、鉴别快速、无需测序,能准确直观地鉴别僵蚕的真伪(包括掺伪)。本专利技术为僵蚕的专属性鉴定提供一条新的途径,有助于监控僵蚕药材的质量,从而有利于保障临床用药的安全性、有效性,具有重要的应用价值。本专利技术通过以下步骤达到快速鉴定僵蚕真伪的目的:本专利技术首先提供一组鉴定僵蚕的特异性引物,所述引物为PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2;PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示,PBM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示;PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示,PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。进一步的,在上述特异性引物鉴定过程中,若受试样品为完整的僵蚕且结果显示为阳性,则判断为正品僵蚕,若受试样品经切片或粉碎,为非完整的僵蚕(如碎片、粉末)且结果显示为阳性,则需进一步鉴定是否为掺伪品(含绿僵菌)。所述鉴定僵蚕的特异性引物还包括引物PMA-1或PMA-2,PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示;PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。所述引物PBM-1或PBM-2均来自于家蚕(Bombyxmori),PBB-1或PBB-2均来自于白僵菌(Beauveriabassiana),并且引物PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2均能达到鉴定僵蚕的目的;引物PMA-1或PMA-2均来自于绿僵菌(Metarhiziumanisopliae),并且均能达到鉴定僵蚕中是否掺伪含绿僵菌的僵蚕的目的。具体的,各引物序列信息如下表所示:本专利技术还提供一种特异性鉴定僵蚕的试剂盒,所述试剂盒包括上述的特异性引物PBM-1或PBM-2引物对、PBB-1或PBB-2引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。进一步的,所述试剂盒还包括上述的特异性引物PMA-1或PMA-2引物对。本专利技术还提供一种利用特异性引物扩增技术鉴定僵蚕的方法,首先采用CTAB法制备供试品溶液,利用CTAB在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,但不沉淀核酸的特性,不仅能同时获取家蚕、白僵菌和绿僵菌的DNA,且DNA浓度和纯度较高,具有操作便捷、成本较低等优势,然后利用PCR及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行:(1)精密称取僵蚕粉末10mg~60mg,加入2×CTAB提取液500μL~1000μL,55℃~65℃水浴1h~6h后,12000r/min离心10min,取上清液;(2)加入与上清液等体积的氯仿/Tris-饱和酚(1:1)混合液,混匀后于12000r/min离心10min,取上清液,加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液,混匀后再次离心,取上清液;(3)加入3M醋酸钾溶液80μL~100μL,再加与上清液等体积的预冷异丙醇,混匀后置于-20℃下冷冻1h或4℃下冷藏过夜;(4)12000r/min离心10min,弃上清液,加入70%乙醇500μL~1000μL洗涤沉淀,再次离心,弃上清液,收集沉淀,室温干燥30min;(5)加入25μL~50μL的TE溶液溶解,-20℃或4℃下保存,备用。一组特异性引物及其鉴定僵蚕的方法,检测方法按照下述步骤进行:(1)以制备的DNA供试品溶液为模板,配制PCR反应体系,设置扩增程序,进行PCR扩增;(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,于凝胶成像分析系统判定结果。步骤(1)中所述的PCR反应体系,以25μL为例,包括:1×PCR缓冲液、2.0mMMgCl2、0.2mMdNTPs、0.1μM~0.4μM引物对、0.625UTaqDNA聚合酶、模板DNA1ng~600ng,加灭菌双蒸水补足至25μL。PCR扩增程序为:95℃3min;95℃30s,56℃~65℃30s,72℃1min,循环数30~40;72℃5min~7min。步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含EB染料的2%~3%TBE琼脂糖凝胶分离后凝胶成像判定结果,上样量为3μL~10μL。本专利技术的有益效果如下:本专利技术直接从分子水平对动物类中药进行鉴定,提供了快速准确鉴定僵蚕真伪的特异性引物及检测方法。该方法中以僵蚕DNA为模板,采用所设计并经筛选后确定的三组特异性引物进行PCR反应,由于目的产物很短(<80bp),非常有益于扩增的进行;所采用的CTAB法可以同时提取出家蚕和菌物中的DNA;此外,通过凝胶电泳分析,根据电泳条带的有无及分子量大小即可快速鉴定僵蚕的真伪和掺伪情况。本专利技术具有操作简单、无需测序、专属性强、快速准确的特点,在动物类药材真伪品快速检测方面具有独特的优势,具有重要的应用价值。附图说明图1是筛选特异性引物PBM-1、PBM-2和PMA-1及PMA-2的电泳结果图。图2是筛选特异性引物PBB-1和PBB-2的电泳结果图。图3是各引物特异性和优化PCR条件的电泳结果图。图4是采用PBM-2和PBB-1对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。图5是采用PMA-1对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。图6采用PBM-2、PBB-1和PMA-1对自制僵蚕饮片进行鉴定的电泳结果图。图7是采用PBM-1和PBB-2对10批自制僵蚕药材进行鉴定的电泳结果图。图8是采用PMA-2对10批自制僵蚕药材进行鉴定本文档来自技高网
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一组鉴定僵蚕的特异性引物及其鉴定方法

【技术保护点】
一组鉴定僵蚕的特异性引物,所述引物为PBM‑1或PBM‑2和PBB‑1或PBB‑2;PBM‑1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示,BM‑2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示;PBB‑1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示,PBB‑2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。

【技术特征摘要】
1.一组鉴定僵蚕的特异性引物,所述引物为PBM-1或PBM-2和PBB-1或PBB-2;PBM-1上下游引物如SEQ.ID.NO.1和2所示,BM-2上下游引物如SEQ.ID.NO.3和4所示;PBB-1上下游引物如SEQ.ID.NO.5和6所示,PBB-2上下游引物如SEQ.ID.NO.7和8所示。2.根据权利要求1所述的鉴定僵蚕的特异性引物,所述引物还包括引物PMA-1或PMA-2;PMA-1上下游引物如SEQ.ID.NO.9和10所示;PMA-2上下游引物如SEQ.ID.NO.11和12所示。3.权利要求1或2所述的引物在鉴定僵蚕真伪或掺伪中的应用。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述应用为首先鉴定僵蚕是否来源于家蚕和白僵菌,其次权利要求1所述引物结合权利要求2所述引物鉴定其中是否掺杂绿僵菌。5.一种特异性鉴定僵蚕的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨欢周莹沈玉萍杨娅娅吴啟南夏国华陈宇菲鹿蓓蓓
申请(专利权)人:江苏大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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