一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一组特异性引物鉴定水蛭的方法，属于中药鉴定技术领域；本发明专利技术首先制备DNA供试品溶液；并以此为模板，选用经设计与筛选得到的特异性核苷酸序列为引物进行PCR扩增，继而将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析与凝胶成像系统检测，最终依据检测结果判别水蛭的真伪和掺伪情况；本发明专利技术的特异性引物扩增法，操作简单，无需测序，结果直观，能够检识掺伪品，同时抗干扰能力强，重复性好，可用于水蛭基原和药材的准确鉴定，并为检测水蛭产品提供了高效快捷的方法，具有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法
本专利技术涉及一组鉴定水蛭的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定领域。
技术介绍
水蛭俗称蚂蟥，为常用动物药材，2015年版《中国药典》规定水蛭为蚂蟥(WhitmaniapigraWhitman)、水蛭(HirudonipponicaWhitman)和柳叶蚂蟥(WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥全体。该中药始载于《神农本草经》，味咸、平，有破血、通经、逐淤的功效，目前临床主要用于治疗微痕积聚、血滞经闭、跌打损伤等。在中药材市场上，水蛭的主要来源为蚂蟥，另有少量的水蛭。随着近年来水蛭的中药制剂的不断开发，水蛭的市场需求增加，导致资源供应短缺，因此水蛭成为了世界性的紧俏药材之一。由于不同品种的水蛭在药理作用上存有差别，以及混伪品、掺伪品在药材市场的流通，严重影响了临床用药的安全与疗效。目前，水蛭的鉴别主要依靠传统的性状鉴别，依赖性强，准确性存疑；此外，经过炮制加工后的药材在形态上难以分辨，因此仅依赖性状鉴别不足以规范水蛭药材的来源。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认标准短序列来进行物种鉴定的一种分子诊断新技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。目前，水蛭的DNA条形码研究主要是基于COI、ITS、12SrRNA等序列进行的，其中以COI序列最为常见。如有研究者利用水蛭的COI序列对水蛭进行DNA分子鉴定研究，即提取水蛭样品的DNA，利用COI通用引物进行PCR扩增，将扩增产物进行测序后，构建N-J聚类分析树，实现了水蛭样品的分类，此类方法操作繁琐耗时费力，仅能够用于检验已知水蛭种类的样品，对未知品种的水蛭则需要与数据库中的序列进行比对确定，而且无法检识掺伪品，难以应用。
技术实现思路
为了克服背景中的问题，本专利技术针对水蛭正品以及常见伪品的物种设计特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别水蛭的新方法。该方法操作简单，无需测序，鉴别快速，能准确直观的实现水蛭真伪的鉴定。本专利技术为水蛭的鉴别提供一条新的途径，有助于监控水蛭药材的质量，从而为临床用药的安全和疗效提供保障，具有极高的应用价值。本专利技术通过以下步骤达到快速鉴定水蛭真伪的目的：本专利技术首先提供一组用于鉴定水蛭的特异性引物，所述引物对为PW或PHN，具体如下所示：PW上下游引物分别为：PW-F：AAGATTCCTTGGAGACGACCPW-R：ATTATAACCAACCCATGAGCCPHN上下游引物分别为：PHN-F：CCAGGTAKATTTCTAGGGGATPHN-R：CCCRCCAATCAAAATAGGTA所述引物对PW或PHN来自于水蛭(HirudonipponicaWhitman)，并且同样能达到鉴定水蛭的目的。所述用于鉴定水蛭的特异性引物还包括引物对PP，具体如下所示：PP上下游引物分别为：PP-F：CTTTAATTACTGCACATGGACPP-R：AATTACCAAACCCACCGAT所述各引物序列详细信息如下：本专利技术还提供一种特异性鉴定水蛭的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物PW或PHN引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳检测体系。在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的水蛭个体且结果显示为阳性，则判断为正品水蛭，若受试样品为水蛭段或粉末，即为非完整的水蛭个体且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含有伪品菲牛蛭)，因此试剂盒还包括特异性引物PP引物对。本专利技术还提供一种特异性鉴定水蛭的方法，首先制备DNA供试品溶液，随后利用PCR及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：(1)将水蛭产品粉碎，40目过筛，收集细粉，加入适量的SDS裂解液和蛋白酶K(料液比：50～200:1mg/mL)，充分混匀，于56℃孵浴提取6h，离心后取上清液；(2)加入与上清液等体积Tris-平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的Tris-平衡酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；(3)加入与上清液等量三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液1/10倍量5M乙酸钾溶液和等量预冷的异丙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；(4)加入预冷的70％乙醇500μL洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量TE缓冲液溶解，-20℃或4℃下保存，备用。一组特异性引物鉴定水蛭的方法，检测方法按照下述步骤进行：(1)以制备的DNA供试品溶液为反应模板，配制PCR反应体系，设置扩增程序，进行PCR扩增；(2)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像分析系统判定结果。其中，步骤(1)中所述的PCR反应体系，以总体积25μL为例，包括：1×PCR缓冲液、2.0mmol/LMgCl2、0.2mmol/LdNTPs、0.1μmol/L～0.2μmol/L引物对、0.625UTaqDNA聚合酶、模板DNA100ng，加灭菌双蒸水补足至25μL。步骤(1)中所述的PCR扩增程序为：95℃3min；95℃30s，50℃～62℃10s～30s，72℃1min，循环数35；72℃，5min～7min。步骤(2)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含荧光染料EB的2％～3％琼脂糖凝胶进行分析后以凝胶成像系统检测，制胶及电泳的缓冲液均为TBE，上样量为10μL。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术的制备方法以SDS裂解液和蛋白酶K为提取溶剂，用恒温混匀仪孵浴，从水蛭产品中提取DNA，然后以酚仿法进行纯化，该方法与柱纯化相比，大大降低了成本，样品用量范围更加灵活，也扩大了适用范围。(2)本专利技术的通过特异性引物鉴定水蛭的方法与传统的基于COI、ITS序列等的DNA条形码鉴定技术相比，不需要扩增完测序的繁琐步骤，直接查看目的条带的位置就能够判断物种，并且能够检识掺伪品，结果直观准确，操作方便快捷，经济高效。附图说明图1是引物PW特异性验证的电泳结果图。图2是引物PW对7批市售蚂蟥样品检测电泳结果图。图3是引物PHN特异性验证的电泳结果图。图4是引物PHN对5批市售水蛭样品检测电泳结果图。图5是引物PP特异性验证的电泳结果图。图6是引物PP对5批市售菲牛蛭样品检测电泳结果图。图7是自制水蛭掺伪品检测电泳结果图。图中，B：标准品121061-201305(蚂蟥)；K：蚂蟥(宽体金线蛭)样品；J：柳叶蚂蟥(尖细金线蛭)样品；F：菲牛蛭样品；R：水蛭(日本医蛭)样品；M：Mark；N：阴性对照；数字代表不同批次。具体实施方式为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施方式进一步描述。本专利技术中涉及到的检测样品材料均来自市售。本专利技术中涉及各样品分别为：B：标准品121061-201305(蚂蟥)；J：柳叶蚂蟥(尖细金线蛭)样品，来自安徽亳州；F：菲牛蛭样品，来自广东东莞；R：水蛭(日本医蛭)样品，来自辽宁；K：蚂蟥(宽体金线蛭)样品；N：阴性对照；M：Mark。7批市售蚂蟥样品中：1、2均来自江苏宿迁，3来自山东德州，4来自广西，5来自浙江；柳叶蚂蟥1、2均来自安徽亳州。5批市售水蛭样品中：1、2均来自辽宁，3来自重庆，4来自山东，5来自湖南。5批市售菲牛蛭样品中：1来自本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于鉴定水蛭的特异性引物，其特征在于，所述引物为PW或PHN，具体如下所示：PW上下游引物分别为：PW‑F：AAGATTCCTTGGAGACGACCPW‑R：ATTATAACCAACCCATGAGCCPHN上下游引物分别为：PHN‑F：CCAGGTAKATTTCTAGGGGATPHN‑R：CCCRCCAATCAAAATAGGTA。

【技术特征摘要】
1.一组用于鉴定水蛭的特异性引物，其特征在于，所述引物为PW或PHN，具体如下所示：PW上下游引物分别为：PW-F：AAGATTCCTTGGAGACGACCPW-R：ATTATAACCAACCCATGAGCCPHN上下游引物分别为：PHN-F：CCAGGTAKATTTCTAGGGGATPHN-R：CCCRCCAATCAAAATAGGTA。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括引物对PP，PP上下游引物分别为：PP-F：CTTTAATTACTGCACATGGACPP-R：AATTACCAAACCCACCGAT。3.权利要求1或2所述的引物在鉴定水蛭真伪或掺伪中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为结合权利要求1所述的引物和权利要求2所述的引物鉴定水蛭中是否掺杂有伪品菲牛蛭。5.一种特异性鉴定水蛭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对、DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨欢，郑阳，沈玉萍，蔡挺，严辉，夏国华，杨娅娅，徐利丽，鹿蓓蓓，陈宇菲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32