用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197、引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197、Tm‑shift引物及其应用。该SNP分子标记ITS197位于SEQ ID NO：1所示的第197位碱基A或G，此处碱基为A的为锡兰钩虫，此处碱基为G的为犬钩虫。基于SNP位点ITS197设计的引物能对锡兰钩虫与犬钩虫进行准确鉴定；两者Tm值的CV分别为0.18％与0.14％；当锡兰钩虫与犬钩虫样品稀释度低至1:10

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197、引物及其应用
本专利技术属于钩虫病诊断和检测
，具体涉及一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197、Tm-shift引物及其应用。
技术介绍
钩虫(Ancylostome)是呈世界性分布的常见寄生虫，可对犬猫和人的健康造成严重的危害。寄生于犬的钩虫有犬钩虫(Ancylostomacaninum)、锡兰钩虫(A.ceylanicum)、巴西钩虫(A.braziliense)和狭头钩虫(Uncinariastenocephala)(ChiltonandGasser,1999)。据调查，近年来中国犬感染的钩虫主要为锡兰钩虫和犬钩虫(Liuetal.,2015)。目前，锡兰钩虫在亚洲已成为感染人的第二大类钩虫(Traub,2013)，特别是在东南亚国家，如中国(Chenetal.,2012；Liuetal.,2014)、日本(Kayaetal.,2016)、马来西亚(Nguietal.,2012)、老挝(Conlanetal.,2012)、泰国(Traubetal.,2008)、印度(Traubetal.,2007)等地。该虫是唯一可在人体内发育为成虫的动物源性钩虫。犬钩虫是分布最为广泛的钩虫种类，在世界范围内均有分布，除感染犬之外，亦可感染人(Bowmanetal.,2010)。上述两种钩虫均为人畜共患的寄生虫，能寄生于宿主的消化道，夺取营养，造成肠道出血、贫血，营养不良和皮炎等严重的症状(Hotezetal.,2014；Georgeetal.,2016)。因此，建立犬源锡兰钩虫和犬钩虫快速准确的鉴定方法对该病的防控显得尤为重要。粪便检查是检测钩虫的传统方法。该方法简便、易行，对于钩虫重度感染具有较好的敏感性，但在轻度感染时容易漏检。由于不同钩虫虫卵形态相似，仅凭外观难以对钩虫进行种类鉴定。目前，分子检测技术已应用于钩虫的鉴别，如特异PCR、多重PCR、限制性内切酶片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)和高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)(Huetal.,2015；Liuetal.,2013；Nguietal.,2012)。但上述技术均存在一定的局限性，如有的无法对大量样品同时进行检测，有的操作繁琐、成本昂贵。近年来，一种基于单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)的Tm-shift分子检测方法引起了人们关注。该方法无需特异性探针，仅在PCR反应体系中预先加入SYBRGreenⅠ荧光染料，PCR结束后根据熔解曲线中Tm值的差异直接对样品进行分析，即可完成SNP的检测(Wangetal.,2005)。它具有高通量、操作简单、准确、成本低和闭管操作等优点(Zhouetal.,2012)。迄今为止，该方法已在医学、微生物学、水生生物学等多个领域应用(Huangetal.,2015；Derzelleetal.,2011；Ahnetal.,2016)。最近，我们建立了猫源蓝氏贾第虫A型与F型的Tm-shift分型方法，开拓了兽医原虫的基因分型方法(Panetal.,2017)。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197。本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的Tm-shift引物。本专利技术的再一目的在于提供上述用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197或Tm-shift引物的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术的技术方案用于非治疗目的和非诊断目的。本专利技术提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197，所述的SNP分子标记ITS197位于SEQIDNO：1所示的第197位碱基A或G，此处碱基为A的为锡兰钩虫，此处碱基为G的为犬钩虫。所述的锡兰钩虫的ITS1-5.8SrDNA部分序列如SEQIDNO：1所示(404bp)，其中，包括309bpITS1(1bp～309bp)和95bp5.8SrDNA(310bp～404bp)。所述的犬钩虫的ITS1-5.8SrDNA部分序列如SEQIDNO：2所示(404bp)，其中，包括309bpITS1(1bp～309bp)和95bp5.8SrDNA(310bp～404bp)。所述的SNP分子标记ITS197在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。用于检测上述SNP分子标记ITS197的试剂也属于本专利技术的保护范围。用于检测上述SNP分子标记ITS197的试剂在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。本专利技术提供一套用于检测人畜共患的犬源锡兰钩虫和犬钩虫的Tm-shiftPCR引物，可用于犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估。首先参考从NCBI下载的犬钩虫(LC177192.1)和锡兰钩虫(KM066110.1)ITS序列，基于ITS1一个SNP位点ITS197设计一套Tm-shiftPCR引物(2条正向特异性引物及1条共同反向引物)，见表1。表1基于ITS1序列SNP位点ITS197的Tm-shift引物含有所述Tm-shiftPCR引物的试剂盒也属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了上述试剂盒在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的方法，包括如下步骤：(1)构建犬源锡兰钩虫和犬钩虫的标准化熔解曲线，使原始数据标准化；(2)提取待测钩虫样品的基因组DNA；(3)以待测钩虫样品的基因组DNA为模板，利用ITS197AF、ITS197EF和ITS197R引物，进行Tm-shiftPCR反应，通过监测待测钩虫样品的实时荧光信号来绘制熔解曲线；(4)根据待测钩虫样品的不同熔点(Tm)并结合不同的峰形来判读样品的钩虫种类。步骤(3)中所述的Tm-shiftPCR的反应体系(表2)和反应条件：表2Tm-shiftPCR反应体系反应条件：本专利技术提供一种上述用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的方法在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。本专利技术的机理是：本专利技术基于犬源锡兰钩虫和犬钩虫rDNAITS1序列一个SNP位点ITS197，探索鉴别犬源锡兰钩虫和犬钩虫的Tm-shift方法，旨在建立一种快速、准确的犬源钩虫种类鉴定方法，以期为犬源钩虫临床检测和人畜共患风险评估提供技术手段。迄今尚无一种Tm-shift方法对犬钩虫混合感染进行检测。与常规PCR和real-timePCR相比，Tm-shiftPCR不但保持了较高的特异性和稳定性，而且较之更为快捷经济；同时在检测犬源钩虫未知种混合感染上具有无可比拟的优势。Tm-shiftPCR即将成为临床疾病实验室诊断或排查的重要手段，它与传统的经典方法相结合，为疾病的快速诊断展示了广阔的应用前景。因此，犬源钩虫Tm-shift快速基因检测技术的建立已成为人们多年来盼望实现的目标。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197，其特征在于：所述的SNP分子标记ITS197位于SEQ ID NO：1所示的第197位碱基A或G，此处碱基为A的为锡兰钩虫，此处碱基为G的为犬钩虫。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS197，其特征在于：所述的SNP分子标记ITS197位于SEQIDNO：1所示的第197位碱基A或G，此处碱基为A的为锡兰钩虫，此处碱基为G的为犬钩虫。2.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记ITS197的试剂。3.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记ITS197的Tm-shiftPCR引物，其特征在于：其核苷酸序列如下：ITS197AF：5′-gcggcgTGAGCATTAGGCTAACGCCTG-3′；ITS197EF：5′-gcgggcagggcgggTGAGCATTAGGCTAACGCCTA-3′；ITS197R：5′-ACGATTCTGCAAACATTAAACGTAAAAAGT-3′。4.含有权利要求3所述的Tm-shiftPCR引物的试剂盒。5.一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建犬源锡兰钩虫和犬钩虫的标准化熔解曲线，使原始数据标准化；(2)提取待测钩虫样品的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国清，王明威，傅叶琪，潘伟达，石先利，胡伟，刘远佳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44