一种头足类线粒体COI基因通用引物及设计和扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种能够高效快捷扩增多种头足类的头足类线粒体COI基因的通用引物及设计和扩增方法，通过设计头足类COI基因的通用引物，能够一次性批量扩增多种头足类COI基因，不需要针对某个单独物种设计特异性引物，既节省了时间成本，又大大提高了工作效率，具有高效快捷的特点，为头足类的种类鉴定、系统进化、种质资源保护和可持续开发利用提供了重要的分子手段及数据积累。

【技术实现步骤摘要】
一种头足类线粒体COI基因通用引物及设计和扩增方法
本专利技术涉及一种头足类线粒体基因组研究领域，尤其涉及一种能够高效快捷扩增多种头足类的头足类线粒体COI基因的通用引物及设计和扩增方法。
技术介绍
头足类是软体功物门的重要类群，广泛分布在世界三大洋及南极海域，不仅具有很高的经济价值，而且在海洋生态中占有重要地位。头足类共有2亚纲、11目、50科、154属约718种，世纪70年代以来，由于世界传统经济种类资源的普遍衰退，处在食物链低端的头足类资源引起了世界各国和地区的重视。据FAO统计，2000年以来，世界头足类产量约为310X104以上，主要为柔鱼科(Ommastrephidae)、乌贼科(Sepiidae)、枪乌贼科(Loliginidae)和章鱼科(Octopodidae)。头足类通常具有生长快、生命周期短的特点，同时种类繁多、种群结构也较为复杂。因而，研究头足类的种群结构，对于保护、合理开发头足类资源有着相当重要的意义。DNA条形码(DNAbarcoding)技术作为近年发展起来的物种鉴定的一门新兴技术,已受到越来越多的关注。其原理是通常利用一段短的线粒体COI(cytochromecoxidasesubunitⅠ)基因序列进行物种鉴定，目前已广泛应用于鱼类、鸟类、爬行类、哺乳类等生物类群，但在头足类中不是很常见。通过设计头足类COI基因的通用引物，能够一次性批量扩增多种头足类COI基因，不需要针对某个单独物种设计特异性引物，既节省了时间成本，又大大提高了工作效率，具有高效快捷的特点。为头足类的种类鉴定、系统进化、种质资源保护和可持续开发利用提供了重要的分子手段及数据积累。中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的专利技术授权，授权公开号：CN104531688B，该专利技术采用提取蜘蛛基因组的总DNA，通过线粒体基因组DNA的长PCR(L-PCR)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，与本专利技术具有异曲同工之妙，但其仅能鉴定蜘蛛线粒体DNA，不能鉴定头足类线粒体COI基因，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长不够方便高效。
技术实现思路
为解决上述现有技术中并没有利用DNA条形码技术对头足类进行鉴定的方法，本专利技术提供了一种可以高效快捷扩增多种头足类线粒体COI基因的通用引物，并提供其设计和扩增方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种头足类线粒体COI基因通用引物，所述头足类线粒体COI基因通用引物能够一次性批量扩增多种头足类COI基因，正向引物为SEQIDNO.1：5’-TCHACAAAYCAYAAAGAYATTGG-3’，反向引物为SEQIDNO.2：5’-TANACTTCTGGGTGNCCAAAAAATCA-3’。作为优选，所述头足类包括西北太平洋柔鱼、荧光乌贼、阿根廷鱿、大王鱿、卷壳乌贼、深海乌贼、半僧头乌贼、莱氏拟乌贼、乳光枪乌贼、曼氏无针乌贼、栗色蛸、剑尖枪乌贼、鸢乌贼、菲律宾双柔鱼、火枪乌贼、中国枪乌贼、日本枪乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、虎斑乌贼、白斑乌贼、目乌贼、拟目乌贼、朴氏乌贼、珠乌贼、针乌贼、椭乌贼、细腕乌贼、长腕乌贼、鹦鹉乌贼、直线豹纹乌贼、叶状腕乌贼、曲针乌贼、金斑乌贼、菱鳍乌贼、短蛸、长蛸、真蛸、条纹蛸、卵蛸、东蛸、沙蛸、小管蛸、多钩钩腕乌贼、安达曼钩腕乌贼和图氏后乌贼。一种头足类线粒体COI基因通用引物的设计，从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的头足类物种COI基因序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列，通用引物扩增长度为600～700bp。一种头足类线粒体COI基因通用引物的扩增方法，所述头足类线粒体COI基因通用引物的扩增方法包括以下步骤：（1）DNA抽提试剂盒法提取待测头足类样品线粒体COI基因；（2）采用权利要求1中所述的头足类线粒体COI基因通用引物；（3）以头足类线粒体COI基因为模版，进行PCR扩增；（4）扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，进行测序。作为优选，所述步骤（1）中为避免头足类肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其触手部提取DNA。作为优选，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。作为优选，所述待测头足类样品包括西北太平洋柔鱼、荧光乌贼、阿根廷鱿、大王鱿、卷壳乌贼、深海乌贼、半僧头乌贼、莱氏拟乌贼、乳光枪乌贼、曼氏无针乌贼、栗色蛸、剑尖枪乌贼、鸢乌贼、菲律宾双柔鱼、火枪乌贼、中国枪乌贼、日本枪乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、虎斑乌贼、白斑乌贼、目乌贼、拟目乌贼、朴氏乌贼、珠乌贼、针乌贼、椭乌贼、细腕乌贼、长腕乌贼、鹦鹉乌贼、直线豹纹乌贼、叶状腕乌贼、曲针乌贼、金斑乌贼、菱鳍乌贼、短蛸、长蛸、真蛸、条纹蛸、卵蛸、东蛸、沙蛸、小管蛸、多钩钩腕乌贼、安达曼钩腕乌贼和图氏后乌贼。本专利技术的有益效果是：1）本专利技术提供的头足类线粒体COI基因通用引物，可以一次性高效批量对多种头足类进行扩增，能够为头足类物种鉴定提供极大的便利；2）本专利技术在头足类线粒体COI基因两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列，扩增长度在600-700bp左右，既有足够的信息位点用于物证鉴定区分，又能保证一个测序反应就能完成，操作简单，节约成本。附图说明图1为本专利技术所提供的头足类线粒体COI基因通用引物扩增不同头足类线粒体COI基因的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中M：DL2000；1：西北太平洋柔鱼（Ommastrephesbartramii）；2荧光乌贼（Wataseniascintillans）；3阿根廷鱿（Illexargentinus）；4大王魷(Architeuthisdux)；5卷壳乌贼（Spirulaspirula）；6；深海乌贼（Bathyteuthisabyssicola）；7半僧头乌贼（Semirossiapatagonica）；8莱氏拟乌贼(Sepioteuthislessoniana)；9乳光枪乌贼（Doryteuthisopalescens）；10曼氏无针乌贼(Sepiellamaindroni)；11栗色蛸（Octopusconispadiceu）。具体实施方式下面结合本专利技术实施例和附图对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述实施例仅为本专利技术一部分实施例，而不是全部实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。实施例（1）头足类样品的采集、鉴定和保存实施例中所用头足类样品均采自野外自然环境中，所采标本均带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类。种类鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种头足类线粒体COI基因通用引物，其特征在于，所述头足类线粒体COI基因通用引物能够一次性批量扩增多种头足类COI基因，正向引物为SEQ ID NO.1 ：5’‑TCHACAAAYCAYAAAGAYATTGG‑3’，反向引物为SEQ ID NO.2 ：5’‑TANACTTCTGGGTGNCCAAAAAATCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种头足类线粒体COI基因通用引物，其特征在于，所述头足类线粒体COI基因通用引物能够一次性批量扩增多种头足类COI基因，正向引物为SEQIDNO.1：5’-TCHACAAAYCAYAAAGAYATTGG-3’，反向引物为SEQIDNO.2：5’-TANACTTCTGGGTGNCCAAAAAATCA-3’。2.根据权利要求1所述的一种头足类线粒体COI基因通用引物，其特征在于，所述头足类包括西北太平洋柔鱼、荧光乌贼、阿根廷鱿、大王鱿、卷壳乌贼、深海乌贼、半僧头乌贼、莱氏拟乌贼、乳光枪乌贼、曼氏无针乌贼、栗色蛸、剑尖枪乌贼、鸢乌贼、菲律宾双柔鱼、火枪乌贼、中国枪乌贼、日本枪乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、虎斑乌贼、白斑乌贼、目乌贼、拟目乌贼、朴氏乌贼、珠乌贼、针乌贼、椭乌贼、细腕乌贼、长腕乌贼、鹦鹉乌贼、直线豹纹乌贼、叶状腕乌贼、曲针乌贼、金斑乌贼、菱鳍乌贼、短蛸、长蛸、真蛸、条纹蛸、卵蛸、东蛸、沙蛸、小管蛸、多钩钩腕乌贼、安达曼钩腕乌贼和图氏后乌贼。3.一种如权利要求1所述的头足类线粒体COI基因通用引物的设计，其特征在于，从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的头足类物种COI基因序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列，通用引物扩增长度为600～700bp。4.一种如权利要求1所述的头足类线粒体COI基因通用引物的扩增方法，其特征在于，所述头足类线粒体COI基因通用引物的扩增方法包括以下步骤：（1）DNA抽提试剂盒法提取待测头足类样品线粒体COI基因；（2）采用权利要求1中所述的头足类线粒体COI基因通...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚理，吕振明，刘立芹，陈永久，杜珣，姜辉，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33