胶质瘤预后标志物circ1:246186743|246186942及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种胶质瘤预后标志物circ1:246186743|246186942及应用。即检测胶质瘤组织来源的circRNA circ1:246186743|246186942的试剂用于制备胶质瘤患者的预后制剂。通过研究证实胶质瘤中circRNA circ1:246186743|246186942表达量较高的患者，拥有较差的术后生存率。通过检测胶质瘤患者胶质瘤组织中circ1:246186743|246186942的表达水平，从而对胶质瘤患者做出预后判断。

【技术实现步骤摘要】
胶质瘤预后标志物circ1:246186743|246186942及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于胶质瘤预后的circRNA标志物、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤预后制剂的应用、还有试剂盒。
技术介绍
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,国内脑胶质瘤的发生率占颅内肿瘤的35％～60％,5年生存率仅为20％～30％,是神经外科临床工作中面临的最严重的肿瘤之一。对脑胶质瘤的治疗措施,传统上仍然以手术为最重要的手段,但由于胶质瘤多为浸润型生长,单纯的手术治疗后,很容易复发,疗效并不能使人满意。因此，寻找胶质瘤预后标志物对患者进行预后分析，以提高胶质瘤患者的术后生存期，并相应地选择合理的后续治疗方案，是神经科学领域亟待解决的研究任务。circRNA是在mRNA前体(pre-mRNA)剪切过程中,外显子的5′端与3′端以反向剪切(backsplicing)形式形成3′,5′磷脂键连接的circRNA。随着测序技术的发展,特别是转录组测序技术(RNA-seq)及其分析技术的发展,细胞内大量的circRNA被发现。现有的研究表明circRNA具有重要的生物学功能。circRNA具有细胞表达特异性,稳定性好且表达丰富等特点,使其作为肿瘤标志物具有潜在意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤患者预后的胶质瘤组织来源的circRNA标志物circ1:246186743|246186942，其序列如SEQNO:1所示。本专利技术的第二个目的是，提供检测所述的circRNA标志物在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂中的应用。本专利技术的第三个目的是，提供一种胶质瘤预后试剂盒，能够测定胶质瘤组织中的circ1:246186743|246186942的含量。所述的胶质瘤预后试剂盒，含有检测circ1:246186743|246186942含量的PCR引物。优选引物的序列如SEQNO:2和3所示。所述的胶质瘤预后试剂盒，除circ1:246186743|246186942的引物外，还含有从胶质瘤组织中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的所有试剂。包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将circ1:246186743|246186942逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及circ1:246186743|246186942所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括circRNAcirc1:246186743|246186942实时荧光定量PCR特异性引物、GAPDH内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。申请人通过荧光定量PCR对12例胶质瘤组织与10例正常脑组织发现进行分析发现，circ1:246186743|246186942在两者中的表达差异明显(P<0.0001)，后对其中10例胶质瘤患者进行生存曲线分析，发现胶质瘤组织来源的circRNAcirc1:246186743|246186942与患者的生存率相关(P＝0.04)，见图2，低表达circRNAcirc1:246186743|246186942的胶质瘤患者预后生存时间较长。此方法为胶质瘤的预后分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胶质瘤患者的术后生存期，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为实时荧光定量PCR检测circ1:246186743|246186942在脑胶质瘤患者胶质瘤组织和正常脑组织中的表达改变；图2为胶质瘤组织中circ1:246186743|246186942表达量与脑胶质瘤患者预后的关系。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例1：制备circRNAcirc1:246186743|246186942用于胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)1.RNA稳定溶液50ml2.异丙醇100ml3.三氯甲烷100ml4.Trizol50ml5.无酶水10ml6.1μM随机逆转录引物50μl7.5×逆转录缓冲液200ml8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100μl9.40U/μlRNA酶抑制剂500μl10.200U/μlMMLV逆转录酶50μl11.PremixExTaq50μl12.10μMcircRNAcirc1:246186743|246186942实时荧光定量PCR特异性引物30μl正向引物：5'-CACGACTTGGCTGAGGAA-3'，反向引物：5'-CCCCACATCACAGGCACA-3'。13.10μMGAPDH特异性引物30μl正向引物为5′-ATCATCAGCAATGCCTCCT-3′，反向引物为5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3′。实施例2：circRNAcirc1:246186743|246186942在胶质瘤组织中的表达量与预后的关系1、收集待测胶质瘤组织放入盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1mlTrizol研钵标本，研磨成液体状后移至tube管，于冰上静止裂解15分钟。裂解结束后4℃，12000rpm离心10min，上清液移至新的tube管。加氯仿200μl于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃，12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置20min，4℃，12000rpm离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。-80℃保存。由实验员每天记录冰箱温度。3、circRNAcirc1:246186743|246186942逆转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如下：成分剂量/管随机逆转录引物(1μM)1μlRNA样本2μg无酶水To12μl逆转录第一步条件：65℃5分钟成分剂量/管5×逆转录缓冲液4μl三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)2μlRNA酶抑制剂(40Μ/μl)1μlMMLV逆转录酶(200Μ/μl)1μl第一步逆转录的产物12μl总体积20μl逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。4、恒生物科技(上海)有限公司合成的circ1:246186743|246186942特异性引物进行实时定量PCR：先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μL反应体系如下：成分剂量/管SYBRPremixExTaq10μl特异性引物(10μM)0.5μlcDNA产物(稀释后)5μl无酶水To20μlPCR的特异性引物：正向引物：5'-CACGACTTGGCTGAGGAA-3'，反向引物：5'-CCCCACATCACAGGCACA-3'。GAPDH内参特异性PCR引物：正向引物为5′-ATCATCAGCAATGCCTCCT-3′，反向引物为5′-CATCAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶质瘤预后标志物circ1:246186743|246186942，其序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种胶质瘤预后标志物circ1:246186743|246186942，其序列如SEQNO:1所示。2.检测权利要求1所述的标志物在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂中的应用。3.一种胶质瘤预后试剂盒，其特征在于，能够测定胶质瘤组织中的circ1:246186743|246186942的含量。4.根据权利要求3所述的胶质瘤预后试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长红，武明花，李沛瑶，刘庆，王蓉，刘强，陈琼，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43