一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物PHF20，以及一种用于检测PHF20的表达水平的试剂盒在神经母细胞瘤检测和诊断或对患者预后评价中的应用，属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域。PHF20的表达高低与临床病理学参数与患者预后密切相关，能够作为一种神经母细胞瘤早期检测的特异性肿瘤标志物或预后指标。

【技术实现步骤摘要】
一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及其应用
本专利技术属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域，涉及一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及应用。
技术介绍
神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)属于神经内分泌性肿瘤，主要起源于肾上腺髓质、颈上、胸腔等部位的交感神经节，临床表现具有恶性度高、多样性和易转移等特点，是最常见的儿童期颅外实体瘤。该病多发于10岁以下的儿童，大约占儿童肿瘤发生的8-10％，年发病率大约为1/10万，仅低于白血病和中枢神经系统肿瘤，虽少数可自行缓解，但是大多数预后较差，神经母细胞瘤具有明显的异质性，对化疗易产生耐药性。目前，在对神经母细胞瘤的治疗中，国际普遍倾向于使用高强度的化学治疗，但该方法使得患者化疗后严重感染的几率较高；而另一方面，对于手术切除的治疗方案而言，由于肿瘤对脏器与血管的侵犯倾向，手术又往往面临着挑战，术后并发症的发生率约占20％，主要涉及肿瘤周围血管及脏器的损伤。因此，找到和研究新的神经母细胞瘤生物标记物和防治靶标，为神经母细胞瘤的早期诊断和靶向治疗打下了基础，并具有重要的意义。PHF20(NCBI登录号NM_016436.4，GeneID:51230，参见SEQIDNO:5)最早发现于神经母细胞瘤的病人的血清自身抗体识别的抗原，其对于细胞重编程有表观遗传调控作用。PHF20蛋白含有多个功能域，其第2个Tudor区域可识别并结合p53，结合后会通过阻止p53的泛素化而稳定和并促进p53的活性转录。目前PHF20在神经母细胞瘤的临床相关性仍然在很大程度上没有被研究，而已有研究又报道其为癌基因，因此，探究其在肿瘤标志物上的应用显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种神经母细胞瘤肿瘤相关的肿瘤标志物。所述肿瘤标志物为PHF20。PHF20有望成为神经母细胞瘤肿瘤诊断和预后判断的标志物，同时为神经母细胞瘤肿瘤的治疗提供了新的靶点。专利技术人研究发现，PHF20在神经母细胞瘤细胞和肿瘤样品中高表达，表达水平与病人不良生存预后存在显著相关性，敲除PHF20对于神经母细胞瘤成瘤有明显的抑制作用。因此，PHF20在神经母细胞癌发生发展过程中可能十分重要。因此PHF20可用于制备神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂。还可用于制备神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒。所述神经母细胞瘤肿瘤干细胞辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括PHF20和内参基因GAPDHRNA的特异性引物,PHF20的特异性上游引物的序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的序列如SEQIDNO.2所示，GAPDHRNA的上游引物的序列如SEQIDNO.3所示，GAPDHRNA的下游引物的序列如SEQIDNO.4所示。PCR引物见表1。所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒和免疫学检测试剂盒。实时荧光定量PCR检测试剂盒所述特异性引物适用于SYBRGreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreen，Taq酶为热启动酶。免疫学检测试剂盒所用PHF20抗体适用于免疫组化检测。试剂盒包括标准切片阳性对照和免疫组化检测相关试剂。表1所述神经胶质母细胞瘤PHF20检测诊断试剂盒用途包括：检测PHF20基因在受试者的测定细胞即神经母细胞瘤中的表达；将所述值与参考值相比较，PHF20基因明显同时高于参考值，表明受试者患有神经母细胞瘤。所述参考值水平是PHF20基因在正常细胞即正常人神经组织细胞中的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变。所述测定细胞已知或被怀疑包含肿瘤细胞。为了验证专利技术的在靶向治疗上有效性，本专利技术通过以下方法验证，1、采用CRISPR基因编辑敲除PHF20基因表达，检测不同组细胞增殖情况。2、采用皮下成瘤方法分别在两个神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS(ATCC编号：CRL-2137TM，人源，上皮样贴壁生长)和SH-EP(ATCC编号：CRL-2269TM，人源，上皮样贴壁生长)中比较PHF20基因敲除情况下肿瘤大小的差别。结果显示，PHF20基因表达被敲除时细胞增殖明显变慢以及皮下成瘤能力明显减弱。本专利技术证实了PHF20基因在癌变的组织细胞中高表达，可作为神经母细胞瘤的检测指标以及靶向治疗的分子靶点。本专利技术为神经母细胞瘤肿瘤的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。因此，本专利技术提供了一种肿瘤生物标志物PHF20作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的用途，PHF20在神经母细胞瘤中表达显著增高。所述肿瘤生物标志物在制备神经母细胞瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。一种肿瘤生物标志物PHF20检测试剂盒，其通过检测PHF20的表达产物检测PHF20的表达水平，其包括PHF20的表达产物的特异性结合物。其中的特异性结合物是特异性检测PHF20mRNA的探针或引物，其采用定量PCR、基因芯片或免疫学方法检测PHF20基因的表达，其中的引物如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，所述试剂盒还包括内参特异性引物，所述内参特异性引物是GAPDHRNA引物，上游引物的序列如SEQIDNO.4所示，GAPDH的下游引物的序列如SEQIDNO.5所示。所述试剂盒可以进一步包括实时荧光定量SYBR染料，例如Roche4887352001LightCycler480SYBRGreenIMaster，还可以包括分子生物学级别H2O。所述试剂盒还可以进一步包含抽提总RNA所用试剂，例如包含Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC水。所述试剂盒还可以进一步包含将总RNA逆转录为cDNA所用试剂。总RNA逆转录为cDNA所用试剂也选择市售的逆转录试剂盒，例如promega逆转录试剂盒(GoScriptTMReverseTranscriptase，A5003)，包括:GoScriptTM5XReactionBuffer、MgCl2、PCRNucleotideMix、RecombinantRibonucleaseInhibitor、GoScriptTMReverseTranscriptase、Nuclease-FreeWater。所述神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断的试剂盒可以是通过免疫学方法进行定量检测的试剂盒，其通过检测PHF20的表达产物检测PHF20的表达水平，其包括特异性结合PHF20的抗体。通过免疫学方法，例如免疫印迹法、免疫组化法和酶联免疫吸附测定法中的至少一种检测PHF20的表达水平，比如，通过免疫印迹法(WesternBlot)进行检测的试剂盒，其中包含免疫印迹法(WesternBlot)相关试剂。进一步地还可以包含从细胞中抽提总蛋白所用试剂，例如包括RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂。PHF20作为神经母细胞瘤药物靶点的用途。一种抑制神经母细胞瘤细胞增殖的药物，其中包含PHF20基因表达抑制剂，其中的基因表达抑制剂是miRNA，siRNA，dsRNA或shRNA或者通过CRISPR基因编辑技术敲除PHF20基因。附图说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤生物标志物PHF20作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的用途，其特征在于PHF20在神经母细胞瘤中表达显著增高。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤生物标志物PHF20作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的用途，其特征在于PHF20在神经母细胞瘤中表达显著增高。2.如权利要求1所述肿瘤生物标志物在制备神经母细胞瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。3.一种肿瘤生物标志物PHF20检测试剂盒，其通过检测PHF20的表达产物检测PHF20的表达水平，所述试剂盒中包括PHF20的表达产物的特异性结合物。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其中的特异性结合物是特异性检测PHF20mRNA的探针或引物，或者是特异性结合PHF20的抗体。5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蔚，何秋萍，
申请(专利权)人：徐州维康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32