人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，具有较高的灵敏度和准确性，克服传统PCR荧光探针法特异性不足、存在假阳性的缺点。该试剂盒通过使用肽核酸(PNA)技术，能够大大降低野生型背景信号，从而提高检测结果的特异性，能检出含10ng基因组中低至0.1％的KRAS突变。此外本试剂盒中的PCR反应液中包括酶溶液等，可直接加入样本检测，简化了操作步骤，使得检测过程更加快捷方便。

【技术实现步骤摘要】
人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种一一Hras、Kras和Nras,分别定位在11、12和1号染色体上。Kras因编码21kD的RAS蛋白又名p21基因。在RAS基因中,Kras对人类癌症影响最大。Kras基因就像体内一个“开关”当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时,则导致细胞持续生长,并阻止细胞自我毁灭。因此,基因在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用,正常的Kras基因可抑制肿瘤细胞生长,而一旦Kras基因发生突变,它就会持续刺激细胞生长,使细胞内信号传导紊乱,打乱生长规律,细胞增殖失控而癌变,从而导致肿瘤的发生。在不同的癌症当中存在不同的Kras基因突变的比例胰腺癌90％、结肠癌50％、肺癌30％、卵巢癌15％、甲状腺癌50％、膀肌癌6％左右另外,红斑性狼疮、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎、肾癌及某些的白血病等都有较高的Kras基因突变水平。肿瘤患者KRAS突变与否显著影响EGFR靶向治疗药物的疗效。最新的临床研究表明：当患者本身不存在KRAS基因突变，服用有关靶向治疗药物，能获得明显的治疗效果。美国癌症综合网络NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测。根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。KRAS基因突变检测已被NCCN列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。KRAS基因突变包括以下七种常见的突变类型：G12D，G12A，G12V，G12S，G12R，G12C，G13D。KRAS基因突变为体细胞突变，因此检测方法也不同于一般性遗传突变检测。所以对检测方法的要求主要有两点:由于样本模板中的突变比例未知，可能突变含量只有1％甚至更低，所以需要高灵敏度的检测方法来检出这些稀有细胞；另一方面由于样本中可能绝大多数是野生型，所以要在绝大多数野生型背景中准确检出突变细胞就需要较高的特异性。检测KRAS基因突变的方法有很多，比如双脱氧测序技术，高分辨溶解曲线，变性高效液相色谱分析，焦磷酸测序法，TaqMan技术，荧光定量PCR技术，直接测序法等。其中各检测法各有其优缺点，因此在该领域需要一种可以高效快速准确全面地检出KRAS基因全部七种突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人类KRAS基因突变检测试剂盒及检测方法，该试剂盒特异性强、灵敏度高且周期短。为实现上述专利技术的目的，本专利技术提供如下的技术解决方案：一种人类KRAS基因突变检测试剂盒，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQIDNO.1。所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成；所述引物探针序列如下：ARMS引物1：5'-ACTCTTGCCTACGCCAT-3'SEQIDNO.2ARMS引物2：5'-ACTCTTGCCTACGCCAG-3'SEQIDNO.3ARMS引物3：5'-CACTCTTGCCTACGCCAA-3'SEQIDNO.4ARMS引物4：5'-CTCTTGCCTACGCCACT-3'SEQIDNO.5ARMS引物5：5'-ACTCTTGCCTACGCCACG-3'SEQIDNO.6ARMS引物6：5'-ACTCTTGCCTACGCCACA-3'SEQIDNO.7ARMS引物7：5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'SEQIDNO.8通用下游引物：5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'SEQIDNO.9特异性探针：FAM-5'-GAGTGCCTTGACGATACA-3'-NFQ-MGBSEQIDNO.10。所述试剂盒还包括外控系统及内控系统，所述外控系统为一对外控引物和相应的外控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体序列如下：外控引物：正向引物F：5'-TCCTGATTTCTGGAAAAGA-3'SEQIDNO.11反向引物R：5'-GAAGAGGGGAAGCTGTA-3'SEQIDNO.12外控探针：FAM-5'-GAAGGACAGGCAACTTG-3'-NFQ-MGBSEQIDNO.13内控引物：正向引物F：5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'SEQIDNO.14反向引物R：5'-CAGACTCCCCATCCCAAG-3'SEQIDNO.15内控探针：VIC-5'-AGCCTGGATAGCAACGTACATG-3'-NFQ-MGBSEQIDNO.16。所述试剂盒还包括阳性质控品及空白对照，所述阳性质控品为含有9种重组质粒的混合液，9种重组质粒混合液包括7种突变重组质粒、内参重组质粒及外控重组质粒；所述空白对照为TE缓冲液。所述试剂盒中包括酶溶液。所述试剂盒中的酶溶液中含有UNG酶。上述人类KRAS基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)设计KRAS基因突变引物探针及针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针，制备试剂盒；(2)取7支突变检测管及1支质控管，分别加入步骤(1)中的PCR反应液；(3)提取待测样本中的DNA模板，分别加入步骤(2)中所述的突变检测管及质控管中，进行荧光定量PCR扩增反应；(4)根据扩增曲线判读Ct值并计算ΔCt，依据参考范围，判定该检测区域是否发生突变。所述荧光定量PCR条件为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃60s，40个循环；37℃2min。本专利技术KRAS基因突变检测试剂盒基于Taqman荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增(ARMS)技术检测KRAS基因2号外显子的12和13密码子上7种常见突变。另外，本专利技术KRAS基因突变检测试剂盒中采用肽核酸技术用于封闭野生型模板，能够大大降低野生型背景信号，提高检测结果的特异性。该试剂盒及检测方法具有以下优点：1.特异性强，针对7种不同突变位点设计相应特异性引物，同时利用肽核酸技术封闭了野生型模板，降低了背景；2.灵敏度高，在20ng野生型基因组DNA背景下，检测出突变含量为1％的DNA；3.一步加样法，操作简洁快速，整个PCR反应能在90分钟内完成；4.加入UNG酶防污染系统，检测过程为闭管操作，显著降低污染。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术的人类KRAS基因突变检测试剂盒，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQIDNO.1。所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成。所述引物探针序列如下：ARMS引本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。

【技术特征摘要】
1.一种人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，含有针对KRAS基因突变位置的PNA肽核酸修饰的特异探针。2.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述肽核酸修饰的探针核苷酸序列为5'-GAGCTGGTGGCGTAG-3'SEQIDNO.1。3.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测KRAS基因7种突变的7对特异性引物和1种特异性探针，7对特异性引物是由7种ARMS引物及1种通用下游引物组成；所述引物探针序列如下：ARMS引物1：5'-ACTCTTGCCTACGCCAT-3'SEQIDNO.2ARMS引物2：5'-ACTCTTGCCTACGCCAG-3'SEQIDNO.3ARMS引物3：5'-CACTCTTGCCTACGCCAA-3'SEQIDNO.4ARMS引物4：5'-CTCTTGCCTACGCCACT-3'SEQIDNO.5ARMS引物5：5'-ACTCTTGCCTACGCCACG-3'SEQIDNO.6ARMS引物6：5'-ACTCTTGCCTACGCCACA-3'SEQIDNO.7ARMS引物7：5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'SEQIDNO.8通用下游引物：5'-CTATTGTTGGATCATATTCGTC-3'SEQIDNO.9特异性探针：FAM-5'-GAGTGCCTTGACGATACA-3'-NFQ-MGBSEQIDNO.10。4.根据权利要求1所述人类KRAS基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括外控系统及内控系统，所述外控系统为一对外控引物和相应的外控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体序列如下：外控引物：正向引物F：5'-TCCTGATTTCTGGAAAAGA-3'SEQIDNO.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李同恩，罗玺，师鸿翔，陈兴京，王蓉蓉，崔斌，陶然，朱兵，
申请(专利权)人：中源协和基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12