一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用制造技术

技术编号:17770492 阅读:66 留言:0更新日期:2018-04-21 23:10
一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用,所述标志物包括SEQ ID No:1所示的has_circ_0117909和SEQ ID No:2所示的has_circ_0005720两种circRNAs。本发明专利技术所提供的儿童ALL诊断用circRNA生物标志物,可用于儿童ALL的诊断,其区分儿童ALL骨髓和正常对照骨髓的AUC可达到0.962,灵敏度达到90.9%,特异度达到95%。

【技术实现步骤摘要】
一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用
本专利技术属于生物
,涉及一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用。
技术介绍
白血病是常见的造血系统恶性增生性疾病,是造血干细胞在分化过程中于某一阶段出现阻滞的一种恶性增殖疾病。儿童急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤,约占15岁以下儿童恶性肿瘤的25-30%。在世界范围内,其年发病率约为3-4/10万人口。我国每年新增病例超过10000例,并且有逐年增高的趋势。尽管随着儿童ALL诊断与治疗方案的不断完善,多种药物联合治疗、支持治疗及造血干细胞移植的应用,儿童ALL的预后较以往有了显著改善,5年生存率达到80-90%,成为一种可治愈性的恶性肿瘤,但仍有约15%的患儿死于化疗副反应及疾病复发。因此,深入研究儿童ALL的发病机制,可以为儿童ALL提供新的诊断依据,也可以为发现新的生物学标志及新的靶向治疗位点提供坚实的理论基础。随着肿瘤分子生物学研究的深入,科学家逐渐将目光转向环状RNA(circularRNA,circRNA),因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点。circRNA是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员,不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明,circRNA具有闭合环状结构,主要通过非典型可变剪切加工产生,广泛存在于各种生物细胞中,具有结构稳定,难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好,表达具有组织及时空特异性等特征,这些特点使得circRNA在疾病诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。目前已经在食管癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤汇总相继发现了具有早期诊断价值的circRNA,但是在儿童ALL领域中尚未见相关circRNA的报道。
技术实现思路
解决的技术问题:本专利技术提供一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用,为儿童ALL的诊断提供参考依据。本专利技术所提供的circRNA生物标志物对于儿童ALL具有很高的灵敏度和特异性,可以作为新型的生物标志物用于儿童ALL的检测。技术方案:一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物,标志物包括SEQIDNo:1所示的has_circ_0117909和SEQIDNo:2所示的has_circ_0005720两种circRNAs。上述引物组合包括:针对has_circ_0117909的特异性引物,针对has_circ_0005720的特异性引物。上述针对has_circ_0117909的特异性引物包括如SEQIDNo:3所示的上游引物,如SEQIDNo:4所示的下游引物;所述针对has_circ_0005720的特异性引物包括如SEQIDNo:5所示的上游引物,如SEQIDNo:6所示的下游引物。上述标志物在制备诊断儿童急性淋巴细胞白血病试剂盒中的应用。上述引物组合在制备诊断儿童急性淋巴细胞白血病试剂盒中的应用。上述引物组合在筛选或制备儿童急性淋巴细胞白血病靶向药物中的应用。一种儿童急性淋巴细胞白血病的诊断试剂盒,包括上述的引物组合。有益效果:(1)本方法采用实时荧光定量RT-PCR对一组circRNA的检测,对儿童ALL的发现和诊断提供参考价值。(2)本方法特异性强,敏感性高,结果稳定,具有广泛的临床应用前景。本专利技术所提供的儿童ALL诊断用circRNA生物标志物,可用于儿童ALL的诊断,其区分儿童ALL骨髓和正常对照骨髓的AUC可达到0.962,灵敏度达到90.9%,特异度达到95%。附图说明图1为has_circ_0117909在儿童ALL与正常对照骨髓中的表达水平图;图2为has_circ_0005720在儿童ALL与正常对照骨髓中的表达水平图;图3为has_circ_0117909用于儿童ALL诊断的ROC曲线图;图4为has_circ_0005720用于儿童ALL诊断的ROC曲线图;图5为has_circ_0117909和has_circ_0005720合并用于儿童ALL诊断的ROC曲线图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式。实施例11、临床样本收集收集南京医科大学附属儿童医院2016年新发的儿童ALL骨髓标本40例及正常儿童对照骨髓30例。所有参加者均签署知情同意书。2、circRNART-PCR实验2.1RNA抽提及定量PCR利用Trizol从骨髓样本中抽提总RNA,用可见光分光光度计对RNA进行定量。2.2引物本专利技术所提供的一组circRNA包括has_circ_0117909和has_circ_0005720。它们均是从儿童ALL患者circRNA芯片检测的结果中筛选出来的,以GAPDH为内参基因(SEQIDNo:7),引物序列如表1所示:表1RT-PCR使用的引物序列2.3逆转录反应采用天根FastQuantRT试剂盒对总RNA进行反转录,RNA起始量为1ug。该试剂盒包含了gDNase,可同时消化基因组DNA。2.3.1基因组DNA消化按照表2配制消化体系,42℃3分钟,冰上冷却。表2成分用量StartingRNASample1μg5×gDNAbeffer2μLTotalVolume10μL2.3.2逆转录反应按照表3配制如下反应体系,加入基因组消化后的产物,共20μL体系,42℃15分钟,95℃3分钟,冰上冷却。表3成分用量10×Fast-RTBuffer2μLFQ-RTPrimerMix2μLRTEnzymeMix1μLRNase-FreeWater5μLVolumeofMix10μL2.3实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR使用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(TliRnaseHPlus)试剂盒,定量仪器为ABI公司的Q3型实时PCR仪。反应体系如表4所示,反应条件为50℃2分钟;95℃3分钟;95℃30秒,60℃1分钟,40个循环;每个实时定量PCR反应分别做三个重复。表4成分用量SYBRPremixExTaq5μL上游引物0.4μL下游引物0.4μLROX0.2μLcDNA模板2μLddH2O2μL总体积10μL3、circRNA表达水平分析采用非配对样本t检验的方法分析儿童ALL骨髓与正常对照骨髓中的circRNA表达差异,双侧P<0.05被认为具有统计学差异。4、circRNA诊断价值分析绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC,来评价这两个circRNA分别诊断儿童ALL以及合并诊断儿童ALL的敏感性和特异性。AUC<0.5时,表示诊断无意义;AUC=0.5-0.7时,表示诊断准确性较低;AUC=0.7-0.9时,表示诊断准确性中等;AUC>0.9时,表示诊断准确性高。5、结果5.1has_circ_0117909和has_circ_0005720在儿童ALL与正常对照骨髓中的表达水平在40例儿童ALL骨髓标本及30例正常儿童对照骨髓标本中,has_circ_0117909表达水平在儿童ALL骨髓中显著上调,P值分别为<0.0001,见(图1);has_circ_0005720表本文档来自技高网
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一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物及其应用

【技术保护点】
一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物,其特征在于所述标志物包括SEQ ID No:1所示的has_circ_0117909和SEQ ID No:2所示的has_circ_0005720两种circRNAs。

【技术特征摘要】
1.一组用于儿童急性淋巴细胞白血病诊断的circRNA标志物,其特征在于所述标志物包括SEQIDNo:1所示的has_circ_0117909和SEQIDNo:2所示的has_circ_0005720两种circRNAs。2.权利要求1所述一组circRNA标志物的引物组合,其特征在于所述引物组合包括:针对has_circ_0117909的特异性引物,针对has_circ_0005720的特异性引物。3.根据权利要求2所述一组circRNA标志物的引物组合,其特征在于所述针对has_circ_0117909的特异性引...

【专利技术属性】
技术研发人员:方拥军薛瑶康美云王娅萍戎留成
申请(专利权)人:南京市儿童医院
类型:发明
国别省市:江苏,32

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