一种环状RNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环状RNA标志物及其在制备用于诊断CTEPH疾病的试剂盒中的应用，该环状RNA标志物为hsa‑circ‑0046159。本发明专利技术还公开了一种试剂盒，该试剂盒含有针对hsa‑circ‑0046159的特异性引物及探针。本发明专利技术能够准确有效地诊断CTEPH疾病，提高了疾病诊断的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA标志物及其应用
本专利技术属于生物医学检验领域，涉及一种用于诊断CTEPH的环状RNA标志物及其特异性引物，还涉及所述标志物在诊断CTEPH中的应用以及相关的试剂盒。
技术介绍
慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolicpulmonaryhypertension，CTEPH)是以呼吸困难、乏力和活动耐力减低为主要表现的一种疾病，主要由于肺动脉血栓栓塞反复发作、不能溶解，进而导致肺血管重构，肺血管阻力进行性升高、肺动脉高压及右心功能不全。CTEPH是一种严重威胁人类生命的疾病，但经过规范化治疗的患者其预后可得到明显改善，因此为了取得更好的治疗效果，应该做到疾病的早诊断、早治疗。目前迫切需要寻找到一个敏感性好、特异性强、易于测量、稳定不受其他可变生物因素影响的用于CTEPH的诊断生物标志物。全血、血清或血浆是最广泛使用的临床途径样品源，寻找到提供早期诊断信息的临床生物标记物，可极大地帮助诊断和处理疾病，为该病的临床早期诊断、疾病分型、严重程度判断等提供有效依据，进而为精准治疗以及新药研发提供依据。环状RNA(circularRNA，circRNA)呈闭合环状，是一类不具有5'末端帽子和3'末端尾巴的特殊内源性非编码RNA，主要由外显子转录产物组成，少数来源于内含子或内含子片段，是目前RNA研究领域的新热点。circRNA存在于多种真核生物中,在同种生物的不同组织中也广泛存在；多数circRNA具有高度保守序列，仅有少数在进化上不保守；大多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核内。而且，部分circRNA具有miRNAsponge功能，与miRNA相互作用，调控靶基因的表达；大多数circRNA能在转录或转录后水平发挥调控作用，少数能在转录水平发挥作用。前人的一些研究发现,circRNA在动脉粥硬化、神经系统紊乱、阮病毒疾病、糖尿病、肿瘤和癌症等疾病发生过程中发挥着重要的作用。因此，对circRNA进行研究具有重要的临床意义。circRNA的组织特异性和稳定性有可能使circRNA成为良好的生物标记物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性强、易于测量、稳定不受其他可变生物因素影响的用于CTEPH诊断的生物标志物。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的诊断CTEPH的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：在对CTEPH疾病进行研究的过程中，发现了一种用于CTEPH诊断的环状RNA标志物，所述标志物为hsa-circ-0046159；其在基因组上的定位为chr:chr17；start(hg19):79523912；end(hg19):79575848；genomiclength:51936,splicedseqlength:3764；其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了上述环状RNA标志物在制备用于诊断CTEPH疾病的产品中的用途。在本专利技术的另一实施方案中，本专利技术还提供了一组寡核苷酸，其是由序列表SEQIDNo.2至序列表SEQIDNo.4所述碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.2和SEQIDNo.3分别为hsa-circ-0046159的正向引物和反向引物，SEQIDNo.4为hsa-circ-0046159的探针。在本专利技术的另一实施方案中，本专利技术还提供了上述寡核苷酸在制备用于诊断CTEPH疾病的产品中的用途。在本专利技术的另一实施方案中，本专利技术还提供了一种诊断CTEPH疾病的试剂盒，包括用于测定hsa-circ-0046159标志物的试剂；其中，所述试剂包括检测hsa-circ-0046159的特异性引物及探针，其中，hsa-circ-0046159正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；hsa-circ-0046159探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术相对于现有技术具有如下优点：(1)血液中circRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创且定量精确，有组织特异性和良好的稳定性，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于慢性血栓栓塞性肺动脉高压的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)通过检测血液来源的circRNAs的表达来诊断人类慢性血栓栓塞性肺动脉高压是否发生的试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的辅助诊断，有助于反映慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的治疗方案提供支持；(3)采用严密的设计和评价体系，本专利技术人初期采用circRNA芯片对circRNA进行分析，且应用QPCR的方法扩大样本进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血液中circRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。附图说明图1为QPCR验证外周血hsa-circ-0046159的表达情况；图2为ceRNA预测结果网络图；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1引物和探针设计根据hsa-circ-0046159的序列，设计引物和探针序列。具体序列如下：hsa-circ-0046159的正向引物：CTCCTGCTTCGGCTCTGThsa-circ-0046159的反向引物：GGATGTAGGCGTGGAAGGhsa-circ-0046159的探针：AAGCGCCTGAAGCAACCATTCGATGAGGAC上述引物由“金唯智生物科技有限公司”合成；探针由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。实施例2totalRNA提取1.每0.25ml全血样品加入0.75ml裂解液RLS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5～10×106个细胞至少加入0.75ml裂解液RLS。裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3：1。2.将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。3.可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。4.每1ml裂解液RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。5.于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加裂解液RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。6.加入1倍体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇！)，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。7.10000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。8.加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。9.加入700μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心60秒，弃掉废液。10.加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。11.将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于CTEPH诊断的环状RNA标志物，其特征在于，所述标志物为hsa‑circ‑0046159；其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于CTEPH诊断的环状RNA标志物，其特征在于，所述标志物为hsa-circ-0046159；其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述的环状RNA标志物在制备用于诊断CTEPH疾病的产品中的用途。3.一组寡核苷酸，其特征在于，由序列表SEQIDNo.2至序列表SEQIDNo.4所述碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQIDNo.2和SEQIDNo.3分别为hsa-circ-0046159的正向引物和反向引物，SEQIDNo.4为hsa-circ-0046159的探针。4.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪冉，杨媛华，翟振国，龚娟妮，李积凤，万钧，张云霞，庞文翼，张萌，刘岩岩，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：北京,11