一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒、方法及其应用技术

技术编号:17770460 阅读:34 留言:0更新日期:2018-04-21 23:09
本发明专利技术提供了一种采用分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物,包含以下核酸序列:扩增CYP2C19基因rs4244285、rs4986893多态性位点的引物对和检测用的探针。本发明专利技术还公开了上述引物和探针在检测扩增CYP2C19基因多态性位点的试剂盒、方法及其应用。本发明专利技术可在一个PCR反应中快速检测CYP2C19基因rs4244285、rs4986893位点多态性,仅需1管PCR反应即可同时检测两个位点,操作简单,结果准确,易于判读。与测序法相比,该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理,PCR扩增和检测同步进行,整个检测过程无需开盖操作,降低了PCR产物造成污染的风险,大大缩短了检测时间,降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒、方法及其应用
本专利技术属于基因检测
,具体涉及一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒、方法及其应用。
技术介绍
CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异,使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer,UM)、快代谢者(extensivemetabolizer,EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer,IM)和慢代谢者(poormetabolizer,PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285,c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893,c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2导致剪接缺失,CYP2C19*3为终止密码子突变。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因,IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型;PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75~85%的PM由CYP2C19*2所致,约20~25%的PM由CYP2C19*3所致。氯吡格雷是一种抗血小板药物,广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少,对血小板的抑制作用下降。美国FDA和美国心脏病学会建议,对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗方案[5],具体意见为:CYP2C19*1/*1基因型个体应用氯吡格雷有效,可常规使用;CYP2C19*2或*3基因型个体对氯吡格雷疗效降低,建议更换成普拉格雷或替卡格雷;CYP2C19*2或*3突变型纯合子个体应用氯吡格雷效果差,建议换用普拉格雷或替卡格雷。目前针对多态性位点分析的方法主要有荧光定量PCR(qPCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RestrictionLengthPolymorphism,PCR-RFLP)、扩增阻滞突变系统-PCR(AmplificationrefractorymutationsystemPCR,ARMS-PCR)等,但是由于这些方法操作步骤多,费时费力,或者需要PCR后处理,易产生污染,因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准,虽然准确,但是操作步骤繁琐且成本较高。本专利技术,接触非对称PCR、分子信标技术和溶解曲线分析技术,专利技术了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒、方法及其应用。为解决上述技术问题,本专利技术采用的技术方案如下:一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物,包括如下核酸序列:(1)扩增CYP2C19基因rs4244285多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示;扩增CYP2C19基因rs4986893多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示;(2)用于检测CYP2C19基因rs4244285多态性位点的分子信标探针,其核苷酸序列如SEQIDNO.:5所示,其中探针的5末端标记FAM,3末端标记DABYSL;用于检测CYP2C19基因rs4986893多态性位点的分子信标序列,其核苷酸序列如SEQIDNO.:6所示,其中探针的5末端标记HEX,3末端标记DABYSL。上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。上述分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物和探针在检测CYP2C19基因多态性中的应用在本专利技术的保护范围之内。一种分子信标探针法用于检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒,该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针,2xPCR反应混合液,阳性标准品。一种分子信标探针法用于检测人类CYP2C19基因多态性的方法,包括如下步骤:(1)提取人外周血基因组DNA;(2)分别以提取的人外周血基因组DNA和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、PCR反应混合液,进行实时荧光定量PCR反应;(3)根据检测到的荧光信号值对rs4244285、rs4986893位点进行溶解曲线基因型判定,其中rs4244285位点选择FAM通道,rs4986893位点选择HEX通道。进一步地,所述步骤(2)中,实时荧光定量PCR反应的扩增体系为:总体积20μL,2xPCR反应混合液10uL,SEQIDNO.:10.02uM,SEQIDNO.:2,0.2uM,SEQIDNO.:30.02uM,SEQIDNO.:40.2uM,SEQIDNO.:50.2uM,SEQIDNO.:60.2uM,模板DNA50ng。更进一步地,所述步骤(2)中,实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为:95℃,2min;95℃,5s,60℃,45s,收集荧光,50个循环;溶解曲线分析程序为:95℃1min;45℃2分钟,45-90℃,连续收集荧光。本专利技术提供了一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物和试剂盒,采用分子信标探针法实现了对CYP2C19基因多态性位点进行快速、简单的检测。本专利技术检测结果准确,易于判读。本专利技术在一个PCR反应中快速检测CYP2C19基因rs4244285、rs4986893位点多态性,仅需1管PCR反应即可同时检测两个位点,操作简单,结果准确,易于判读。与测序法相比,该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理,PCR扩增和检测同步进行,整个检测过程无需开盖操作,降低了PCR产物造成污染的风险,大大缩短了检测时间,降低了检测成本。附图说明图1为不同基因对应的检测结果示意图;(a)rs4986893位点分型结果示意图:(b)rs4244285位点分型结果示意图。具体实施方式根据下述实施例,可以更好地理解本专利技术。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1:步骤1:DNA提取取200μL外周血,按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取(购自杭州新捷生物科技有限公司),提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。步骤2:PCR扩增和检测(1)扩增CYP2C19基因rs4244285多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示;扩增CYP2C19基因rs4986893多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示;(2)用于检测CYP2C19基因rs4244285多态性位点的分子信标序列,其核苷酸序列如SEQIDNO.:3所示,其中探针的5末端标记FAM,3末端标记DABSYL;用于检测CYP2C19基因rs4986893多态性本文档来自技高网
...
一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒、方法及其应用

【技术保护点】
一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物,其特征在于,包括如下核酸序列:(1)扩增CYP2C19基因rs4244285多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示;扩增CYP2C19基因rs4986893多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示;(2)用于检测CYP2C19基因rs4244285多态性位点的探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示,其中探针的5末端标记FAM,3末端标记DABYSL;用于检测CYP2C19基因rs4986893多态性位点的分子信标序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示,其中探针的5末端标记HEX,3末端标记DABYSL。上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。

【技术特征摘要】
1.一种分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物,其特征在于,包括如下核酸序列:(1)扩增CYP2C19基因rs4244285多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:1和SEQIDNO.:2所示;扩增CYP2C19基因rs4986893多态性位点的引物对,其核苷酸序列如SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示;(2)用于检测CYP2C19基因rs4244285多态性位点的探针,其核苷酸序列如SEQIDNO.:5所示,其中探针的5末端标记FAM,3末端标记DABYSL;用于检测CYP2C19基因rs4986893多态性位点的分子信标序列,其核苷酸序列如SEQIDNO.:6所示,其中探针的5末端标记HEX,3末端标记DABYSL。上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。2.一种权利要求1所述的分子信标探针法检测人类CYP2C19基因多态性的引物在检测CYP2C19基因多态性中的应用。3.一种分子信标探针法用于检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针,以及2xPCR反应混合液,阳性标准品。4.一种分子信标探针法用于检测人类CYP2C19基因多态性的方法,其特征在于,包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员:任绪义张锋
申请(专利权)人:南京迪安医学检验所有限公司
类型:发明
国别省市:江苏,32

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1