抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪的筛选及其肠道内容物样品的采集；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物菌群的高通量测序；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物宏基因组学对比分析；以及抗大肠杆菌感染的益生菌的筛选及鉴定。本发明专利技术提出的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，有针对性地从抗病仔猪肠道庞大的微生物菌群中筛选具有抗大肠杆菌感染的益生菌，准确性高、针对性强、节省时间。

【技术实现步骤摘要】
抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法
本专利技术涉及畜牧兽医
，尤其涉及一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法。
技术介绍
在现代化的集约化养猪生产过程中，仔猪的饲养已成为最重要的环节之一。欧盟等国家早在1999年就制定法律来禁用抗生素作为促生长剂，并于2006年全面禁止抗生素作为促生长剂的使用。因此需要寻找和探究优质、安全的抗生素替代产品。益生菌能通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂，具有帮助维持肠道正常功能，有促进营养吸收、刺激机体免疫系统、提高抗病能力的功效。猪大肠杆菌病是由原性大肠杆菌引起的仔猪肠道传染性疾病。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和水肿病三种，以发生肠炎、肠毒血症为特征。建立一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌筛选方法，有利于筛选出高效的专用益生菌，对防治猪大肠杆菌感染具有重要意义。尽管目前我国已开展了大量的益生菌的筛选工作，并且广泛应用于生产实践，但是这些益生菌主要是用于促进动物肠道营养物质的消化吸收，促进生长，且很多益生菌并非来源于本体动物，进入宿主体内后，很难与宿主适应，难以发挥其确切功效。传统的益生菌筛选技术主要包括体外抑菌法和体内攻菌方法，存在着盲目性、效率低、针对性不强，以及多为外源菌等缺点。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，旨在解决传统的益生菌筛选技术存在的盲目性、效率低、针对性不强，以及多为外源菌的缺点。为实现上述目的，本专利技术提出了一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：步骤S10、挑选大肠杆菌感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪大肠杆菌感染的益生菌。优选地，步骤S10包括：在大肠杆菌感染爆发的猪场，通过临床症状观察和病理损伤检测，并结合大肠杆菌的定性PCR检测，从定性PCR检测呈阳性的仔猪群中，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病仔猪和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病仔猪；对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品，于-80℃保存备用；其中，临床症状观察包括仔猪黄痢、白痢、出血样腹泻、呕吐等典型临床症状的观察，病理损伤检测包括仔猪肠内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短等病理损伤的剖检。优选地，步骤S20包括：用试剂盒提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中微生物菌群的基因组，获得微生物菌群中不同微生物的16srRNA基因；利用16srRNA通用引物扩增不同微生物的16srRNA基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定后，再利用标签引物进行第二次扩增，并对第二次扩增的片段进行浓度测定，然后将第二次扩增的产物稀释到相同浓度后，等量混合，用以构建测序文库；构建测序文库完成后，将第二次扩增的产物用NaOH进行变性后，利用测序试剂盒和测序仪进行基因序列测定。优选地，步骤S30包括：对高通量测序的测序数据进行α多样性和β多样性分析，对聚类的肠道微生物OTU进行物种诠释，分析发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群的物种分布，并分析比较发病仔猪和抗病仔猪肠道的核心菌群和差异菌群。优选地，步骤S40包括：根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株；将抗病仔猪肠道菌群接种到肉汤培养基中进行厌氧培养，然后对肠道菌群中的目的菌株进行选择培养基固体平板划线培养，再根据目的菌株的菌落特性，挑选选择培养基固体平板上的阳性菌落接种到液体选择培养基中进行增菌培养，即获得所筛选的抗猪大肠杆菌感染的益生菌；对所筛选的益生菌进行生化特性鉴定和16srRNA全基因测序鉴定，鉴定出所筛选的益生菌为罗伊氏乳杆菌和肠膜明串珠菌。优选地，在步骤S40之后，还包括：步骤S50、将所筛选的益生菌接种至试验仔猪体内，然后对试验仔猪进行大肠杆菌攻毒试验，统计试验仔猪的腹泻率，并测定试验仔猪肠道组织形态结构及免疫细胞、免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，根据腹泻率的统计结果、肠道组织形态结构及免疫细胞、免疫炎性因子和黏膜功能蛋白质水平，来分析所筛选的益生菌抗猪大肠杆菌感染的效果；其中，所述试验仔猪为没有进行大肠杆菌免疫的新生仔猪。优选地，步骤S50包括：步骤S51、将没有进行大肠杆菌免疫的3日龄仔猪用人工代乳粉饲喂，作为试验仔猪，并随机分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组；步骤S52、将所筛选的益生菌进行体外培养后，从3日龄早上开始对试验仔猪接种益生菌，至试验仔猪生长至7日龄，其中，Ⅰ组试验仔猪接种生理盐水，Ⅱ组试验仔猪接种罗伊氏乳杆菌，Ⅲ组试验仔猪接种肠膜明串珠菌，Ⅳ组试验仔猪同时接种罗伊氏乳杆菌和肠膜明串珠菌；步骤S53、于7日龄晚上对Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组试验仔猪使用大肠杆菌进行攻毒，攻毒后持续观察48h，记录试验仔猪的发病情况，统计腹泻率；步骤S54、攻毒48h后，通过前腔静脉采血采集试验仔猪的血样并分离血清，测试血清免疫及炎性因子含量；同时，采血后屠宰试验仔猪并取其肠道黏膜组织样品，测定试验仔猪肠道组织形态结构、及免疫细胞数量和密度，以及肠道黏膜功能蛋白表达量；根据腹泻率的统计结果，血清免疫及炎性因子含量，肠道组织形态结构、及免疫细胞数量和密度，以及肠道黏膜功能蛋白表达量，来评判试验仔猪抗大肠杆菌感染的能力。优选地，在步骤S52中：试验仔猪自3日龄至7日龄接种益生菌的剂量依次为5×102cfu/100uL、5×103cfu/100uL、5×104cfu/100uL、5×105cfu/100uL、5×106cfu/100uL；Ⅳ组试验仔猪接种罗伊氏乳杆菌的剂量与接种肠膜明串珠菌的剂量相同。优选地，在步骤S53中：试验仔猪使用大肠杆菌进行攻毒的的攻毒剂量为2×109cfu。优选地，在步骤S54中：所述血清中免疫及炎性因子包括白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、干扰素α、肿瘤坏死因子-α和肠型脂肪酸结合蛋白；所述免疫细胞包括杯状细胞、淋巴细胞和固有层细胞，所述免疫炎性因子；所述肠道黏膜功能蛋白包括热休克蛋白70、Caspase-3蛋白、Bax蛋白、闭合蛋白Occludin和Claudin-1、以及绒毛蛋白。本专利技术提供的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，采用从发病仔猪和抗病仔猪的肠道菌群宏基因组学大数据分析入手，有针对性地从抗病仔猪道庞大的微生物菌群中筛选具有抗大肠杆菌感染的益生菌，所筛选的益生菌来源于本体动物，避免了益生菌与宿主的不适应，且针对性强，准确性高，节省了大量的人力、物力及时间。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S10、挑选大肠杆菌感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪大肠杆菌感染的益生菌。

【技术特征摘要】
1.一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S10、挑选大肠杆菌感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪大肠杆菌感染的益生菌。2.如权利要求1所述的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，所述的步骤S10包括：在大肠杆菌感染爆发的猪场，通过临床症状观察和病理损伤检测，并结合大肠杆菌的定性PCR检测，从定性PCR检测呈阳性的仔猪群中，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病仔猪和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病仔猪；对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品，于-80℃保存备用；其中，临床症状观察包括仔猪黄痢、白痢、出血样腹泻、呕吐等典型临床症状的观察，病理损伤检测包括仔猪肠内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短等病理损伤的剖检。3.如权利要求1所述的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，所述的步骤S20包括：用试剂盒提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中微生物菌群的基因组，获得微生物菌群中不同微生物的16srRNA基因；利用16srRNA通用引物扩增不同微生物的16srRNA基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定后，再利用标签引物进行第二次扩增，并对第二次扩增的片段进行浓度测定，然后将第二次扩增的产物稀释到相同浓度后，等量混合，用以构建测序文库；构建测序文库完成后，将第二次扩增的产物用NaOH进行变性后，利用测序试剂盒和测序仪进行基因序列测定。4.如权利要求1所述的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，所述的步骤S30包括：对高通量测序的测序数据进行α多样性和β多样性分析，对聚类的肠道微生物OTU进行物种诠释，分析发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群的物种分布，并分析比较发病仔猪和抗病仔猪肠道的核心菌群和差异菌群。5.如权利要求1所述的抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，所述的步骤S40包括：根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株；将抗病仔猪肠道菌群接种到肉汤培养基中进行厌氧培养，然后对肠道菌群中的目的菌株进行选择培养基固体平板划线培养，再根据目的菌株的菌落特性，挑选选择培养基固体平板上的阳性菌落接种到液体选...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，侯永清，丁斌鹰，易丹，赵迪，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42