一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，将不同微生物的小种等量均匀混合后提取总核酸；构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点；在候选位点两侧设计多重扩增引物；对多重引物的筛选后即获得新的高多态性分子标记位点。理论上本发明专利技术可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，并且可以直接用于品种的高通量检测，不需要传统筛选方法中的反复验证过程；在应用上本方法所筛选出的分子标记位点可以批量检测，不需要对每个分子标记位点一个一个的做分子扩增和检测，因而加快了检测速度，并提高了准确性；本发明专利技术筛选出的分子标记多态性高、分辨率好，且筛选过程简单、快速且流程规范。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法
本专利技术公开了一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，属于生物

技术介绍
分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，分子标记技术广泛应用于基因定位、遗传图谱分析、法医以及新品种的审定等领域，具有广泛的应用价值和理论研究意义。但是由于受到现有分子标记的开发方法的限制，目前可用的分子标记数量都非常少，甚至某些物种缺乏可用的分子标记位点。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术至少存在以下问题：16SrDNA只能区分到种，无法在小种的水平上做区分；传统高多态性分子标记的开发多是依赖于研究者的个人经验，通过大量验证试验来获得，其过程耗费巨大、周期漫长，且不一定能获得真正高多态性的标记位点。而且整个开发过程一次只能找出一个高多态性的分子标记位点，而对于基因组上存在的众多其潜在的高多态性分子标记位点则无能为力。传统的高多态性分子标记在应用中多是一个标记一个标记的的检测，无法大规模的高通量的检测多个分子标记位点。部分物种目前有丰富的变异位点信息，但是却不一定会适用于所有的品种。因而批量寻找合适的分子标记位点是目前分子标记的研究和应用的最大障碍。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，可以一次性筛选出基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，实现批量筛选，批量检测。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，包括如下步骤：将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。作为进一步的优选，所述微生物小种数量大于5个，过少的小种数量将影响分子标记的多态性的评估。作为进一步的优选，所述等量混合为：每个品种之间的基因组摩尔数比例为(0.9-1):(1-1.2)，构建高通量测序文库时不同小种间均匀混合。作为进一步的优选，所述高覆盖度的测序包括：获得可覆盖基因组的核酸测序片段，且所述测序片段数量高于子类的数量。作为进一步的优选，所述将测序结果比对到所述检测物种的参考基因组上，包括：以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为所述窗口内的一个基因型，获得所述窗口的所有候选基因型。作为进一步的优选，所述窗口平移包括：窗口长度设为L；统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖所述窗口的测序片段的总数量，获得所述基因型的频率。作为进一步的优选，所述单拷贝区域为：基因组上其他位置不存在对单拷贝区域形成干扰的基因组片段。作为进一步的优选，所述在保守区域设计分子标记的多重扩增引物，保守区域都筛选包括：对于长度为L的一个滑动窗口，窗口在基因组上的起始位置设为S,该窗口终止位置为E，则窗口左侧保守区定义为坐标位置小于S、在测序数据中以及已有的数据中均未发现变异的连续n个碱基位点，窗口左侧保守区定义为坐标位置大于E、在测序数据中以及已有的知识中均未发现变异的连续n个碱基位点。作为进一步的优选，在所述保守区域内设计的引物3末端不含有低复杂序列，如连续多个A，连续的AT重复片段等。作为进一步的优选，所述对所述多重扩增引物筛选包括：验证分子标记间的扩增均一性。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法包括将不同微生物的小种等量均匀混合后提取总核酸；构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点；在候选位点两侧设计多重扩增引物；对多重引物的筛选后即获得新的高多态性分子标记位点。理论上本专利技术可以一次性筛选出微生物基因组上所有可用的高多态性分子标记位点，并且可以直接用于不同微生物小种的高通量检测，不需要对每个分子标记位点一个一个的做分子扩增和检测，因而加快了检测速度，并提高了准确性；筛选出的分子标记多态性高、分辨率好，且筛选过程简单、快速且流程规范。具体实施方式本专利技术通过提供一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，解决了现有技术中高多态性分子标记开发困难、现有标记对不同类群的区分度低的问题。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：本专利技术实施例筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，包括如下步骤：将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口内突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。本专利技术实施例不需要目标物种的现有分子标记的信息，也无需传统的筛选过程中所需要的构建遗传群体信息，只需通过高通量测序可以一次性地检测基因组上所有高多态性的分子标记位点，筛查过程简单、快速且流程规范。在应用上本方法开发出的高多态性分子标记位点的检查方法可以利用扩增子测序技术实现一次扩增和测序就能检查所有分子标记位点，检测方法快速、准确、通量高，普遍适用于各种基于分子标记开展的各项研究和应用。为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。如未加特殊说明，本专利技术中所用试剂均为市场上常见试剂，大多数生物技术公司均有销售，且效果等同。实施例一、菠萝泛菌高多态性分子标记位点的筛选本实施例中，选取6个具有表型差异的菠萝泛菌小种为材料，本实施例的目的是批量筛选出一批可以有效区分各小种的分子标记位点。一、混合基因组DNA的提取用液体细菌培养基将各小种在37℃恒温摇床上过夜培养，其培养基配方为蔗糖10g、谷氨酸钠5g、蛋氨酸0.1g、磷酸二氢钾1g、氯化铵1g、氯化镁1g、EDTA螯合的亚铁离子1ppm及无菌水1L，pH6.4～6.7。各小种过夜培养后利用紫外分光光度计(NanoDroponeC,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定菌液的OD值。OD值达到平台期时各菌液吸出0.5ml并混匀，然后在高速离心机上以10000rpm的速度离心收集菌体。然后用1ml去离子水将具体吹散并再次离心收集菌体。然后用利用细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：EE-101，生产公司：北京全式金生物技术有限公司)按其操作手册所述的方法提取获得的混合样品的核酸。本方案所用菠萝泛菌小种PantoeaananatisLMG20103，PantoeaananatisLMG2665，PantoeaananatisLMG5342，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：包括如下步骤：将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。

【技术特征摘要】
1.一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：包括如下步骤：将不同品种的微生物小种等量混合后抽提总核酸，构建高通量测序文库；采用高通量测序的方法对所述高通量测序文库进行高覆盖度的测序，获得测序片段；并将测序结果比对到所述小种的参考基因组上；根据比对结果获取所有的突变位点；按照窗口平移获得每个窗口的突变位点的组合数，并将每种组合的测序片段数量换算成所述窗口上所有测序片断的百分比；计算每个窗口的多态性，并评估该窗口是否处于单拷贝区域，得到候选位点；寻找候选位点两侧的保守区域，在所述保守区域设计分子标记的多重扩增引物；对所述多重扩增引物筛选，获得新的高多态性分子标记位点。2.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述微生物小种数量大于5个。3.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述等量混合为：每个品种之间的基因组摩尔数比例为(0.9-1):(1-1.2)。4.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述高覆盖度的测序包括：获得可覆盖基因组的核酸测序片段，且所述测序片段数量高于子类的数量。5.根据权利要求1所述的筛选微生物高多态性分子标记位点的方法，其特征在于：所述将测序结果比对到...

【专利技术属性】
技术研发人员：方治伟，方光明，李伦，周俊飞，彭海，刘致浩，李甜甜，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42