一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法制造技术

本发明专利技术涉及荧光定量PCR检测方法技术领域，特别涉及一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法，该方法利用实时荧光定量PCR技术分析芒果不同组织的EIF1A基因表达量，以MiGAPDH为内参基因，设计内参基因引物和目的基因引物；以逆转录的cDNA为模板，在Light

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法
本专利技术涉及荧光定量PCR检测方法
，特别涉及一种用于检测芒果EIF1A基因的引物及实时荧光定量PCR法。
技术介绍
真核翻译起始因子1A(eukaryotictranslationinitiationfactor,eIF-1A)的功能主要是参与蛋白质合成起始的第1步，即在EIF1A等的参与下使eIF2:GTP:tRNA组成三元复合体，该复合体与40S核糖体亚基结合而启动翻译过程。EIF1A在肽链的合成起始中起重要作用,是重要的蛋白合成调控因子之一。而目前并未发现有关芒果的EIF1A基因在芒果不同组织的分布情况的研究。荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，也称为定量PCR，简称为QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；一般情况下，为了荧光定量技术保证理想的扩增效率(90％～110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。在文库定量的荧光定量PCR实验中扩增效率会随着扩增产物长度的增加而降低，为保证较好的扩增效率(90％～110％)，荧光定量PCR实验Taqman水解探针法的扩增产物大小最好保持在50bp～150bp。因此文库的片段长度是影响扩增效率的主要因素，而芒果的EIF1A全长序列全长达到604bp，其扩增是有一定难度的，因此，如何能提高扩增效率，更好的应用荧光定量PCR来对芒果不同组织进行定量分析是本申请需要解决的技术问题。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种有效的方法，能提高扩增效率，更好的应用荧光定量PCR来对芒果不同组织进行定量分析。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于检测芒果EIF1A基因的引物，所述引物包括用于扩增目的基因的目的EIF1A基因引物对和用于扩增内参基因的MiGAPDH基因引物对；所述EIF1A基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’-TCAAGGAAGATGGGCAAGAG-3’；下游引物序列：5’-ACGGATGTGGCAAAGACG-3’；所述MiGAPDH基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’-CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA-3’；下游引物序列：5’-CAAGGGGCTCATCACAAACA-3’。本申请还提供了一种应用如权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测的方法，所述方法包括：目的基因总RNA提取、目的基因cDNA的合成、荧光定量PCR扩增检测。进一步的，所述目的基因总RNA提取包括如下步骤：(1)取不同的芒果组织样品速冻后，分别保存于-70℃～-80℃的冰箱中，分别用氮液将100mg-200mg的不同芒果组织样品研磨成粉，然后转移到2.0mL-3.0mL的离心管I中再加入1mL-2mL细胞裂解液；(2)在步骤(1)的离心管中加入300μL-600μL的去蛋白液，混匀30s-50s后取下层溶液转入含200μL-400μL氯仿的离心管II中，将离心管II中的液体充分混合混合，并在振荡器上振荡，混匀30s-50s；(3)将步骤(2)的离心管II放入4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下进行离心，离心时间为8min-10min；离心后取上清液500μL-700μL转移到2.0mL-3.0mL离心管Ⅲ中；(4)加入与步骤(3)离心管Ⅲ中的上清液与等体积的漂洗液，充分颠倒混匀，将混合物，加入离心吸附柱中，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；(5)向步骤(4)离心后的离心吸附柱中加入500μL-700μL的洗柱液，在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下离心1min-2min，弃掉穿透液；然后再向离心吸附柱中加入500μL-700μL洗柱液，再在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min离心1min-2min，去除残留的液体；(6)将步骤(5)的离心吸附柱转移到无RNA酶1.5ml-2ml离心管收集管中，加入50μL-70μL洗脱液，在室温条件下放置5min-8min；(7)将步骤(6)的离心管收集管在4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下离心1min-2min，收集离心管中溶液得到不同芒果组织样品的总RNA。进一步的，所述目的基因cDNA的合成方法为：将不同芒果组织样品的总RNA样品各取各1μg-2μg做为模板进行逆转录，逆转录完后取5μL-7μL产物进行琼脂糖电泳检测，检测之后可保存于-15℃～-20℃冰箱中，得到不同芒果组织样品的cDNA。进一步的，所述荧光定量PCR扩增检测方法为：将不同芒果组织样品的cDNA为作为定量PCR的模板，以芒果3-磷酸甘油醛脱氢酶基因MiGAPDH为内参基因，以EIF1A基因引物对和MiGAPDH基因引物对分别在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应；所述PCR反应的反应体系为：所述PCR反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火20s，共计45个循环，采集荧光信号；95℃变性1s，65℃退火15s，1个循环，制定溶解曲线；40℃冷却30s。本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术中申请人根据芒果的EIF1A基因特异性的设计相应引物进行PCR扩增，能有效提高EIF1A基因的扩增效率，本申请使用荧光定量PCR实验对芒果不同组织的EIF1A基因进行定量分析，能快速、准确的检出EIF1A基因在芒果不同组织中的表达与分布情况，为克隆以及利用该基因提供科学依据。【附图说明】图1是芒果不同组织的总RNA凝胶电泳检测图；其中，M条带从上到下依次为2000bp、1500bp、750bp、500bp、250bp和100bp；编号1-4分别为芒果叶、芒果茎、芒果花和芒果果实的总RNA凝胶电泳图图2是芒果EIF1A基因在不同芒果组织中的荧光定量分析结果图。【具体实施方式】本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例：1、实验材料：四季芒果的不同组织样品：包括叶、茎(已木质化)、花、果实，分别在不同时期采样，速冻后，并保存于-80℃(本实施例仅给出了一个最佳的实施温度，经专利技术人研究发现，当保存温度为-70℃～-80℃均能满足本申请样品保存的温度需求)冰箱。2、目的基因总RNA提取：2.1芒果叶总RNA提取：(1)取芒果老叶，用氮液将100mg的芒果老叶研磨成粉后转移到2.0mL的离心管I中再加入1mL细胞裂解液；(2)在步骤(1)的离心管中加入300μL的去蛋白液，混匀30s后取下层溶液转入含200μL氯仿的离心管II中，将离心管II中的液体充分混合混合，并在振荡器上振荡，混匀30s；(3)将步骤(2)的离心管II放入4℃，120本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测芒果EIF1A基因的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增目的基因的目的EIF1A基因引物对和用于扩增内参基因的MiGAPDH基因引物对；所述EIF1A基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’‑TCAAGGAAGATGGGCAAGAG‑3’；下游引物序列：5’‑ACGGATGTGGCAAAGACG‑3’；所述MiGAPDH基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’‑CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA‑3’；下游引物序列：5’‑CAAGGGGCTCATCACAAACA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测芒果EIF1A基因的引物，其特征在于，所述引物包括用于扩增目的基因的目的EIF1A基因引物对和用于扩增内参基因的MiGAPDH基因引物对；所述EIF1A基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’-TCAAGGAAGATGGGCAAGAG-3’；下游引物序列：5’-ACGGATGTGGCAAAGACG-3’；所述MiGAPDH基因引物对的引物序列如下：上游引物序列：5’-CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA-3’；下游引物序列：5’-CAAGGGGCTCATCACAAACA-3’。2.一种应用如权利要求1所述引物进行荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，所述方法包括：目的基因总RNA提取、目的基因cDNA的合成、荧光定量PCR扩增检测。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因总RNA提取包括如下步骤：(1)取不同的芒果组织样品速冻后，分别保存于-70℃～-80℃的冰箱中，分别用氮液将100mg-200mg的不同芒果组织样品研磨成粉，然后转移到2.0mL-3.0mL的离心管I中再加入1mL-2mL细胞裂解液；(2)在步骤(1)的离心管中加入300μL-600μL的去蛋白液，混匀30s-50s后取下层溶液转入含200μL-400μL氯仿的离心管II中，将离心管II中的液体充分混合混合，并在振荡器上振荡，混匀30s-50s；(3)将步骤(2)的离心管II放入4℃，12000rpm/min-15000rpm/min的条件下进行离心，离心时间为8min-10min；离心后取上清液500μL-700μL转移到2.0mL-3.0mL离心管Ⅲ中；(4)加入与步骤(3)离心管Ⅲ中的上清液与等体积的漂洗液，充分颠倒混匀，将混合物，加入离心吸附柱中，在4℃，1200...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽淑，何新华，罗聪，
申请(专利权)人：广西大学，广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西,45