一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法。以数字PCR为检测平台，针对EGFR G719X基因的三种变异形式设计用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、探针，并将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR微反应液滴进行PCR扩增反应，判断待测样品中是否含有EGFR G719X基因变异的模板和发生突变的模板含量。本发明专利技术的引物和探针特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达0.01％；且利用此套引物进行PCR扩增，扩增出来的片段仅94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，能从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用；本方法能一次检测EGFR G719X基因的三种变异形式，大大降低临床检测成本及工作量。

【技术实现步骤摘要】
一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法
本专利技术涉及生物
中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法。
技术介绍
非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，尽管手术和化疗技术不断提高，但患者的预后仍较差，5年存活率小于20％。目前，以人表皮生长因子受体(epitheliumgrowthfactorreceptor,EGFR)为靶点的分子靶向治疗已成为治疗NSCLC最重要的方式。目前临床上使用的针对EGFR的靶向药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，EGFR-TKI通过抑制EGFR自身磷酸化而阻断EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖分化，实现靶向治疗。EGFR-TKI的疗效与EGFR基因突变状况密切相关，EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性密切相关。EGFR基因突变除了常见的19外显子缺失和L858R活性突变外，外显子18点突变G719X大约占4％。这种突变EGFR-TKI治疗通常反应良好。因此，EGFR基因外显子18点突变G719X的检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，然而目前EGFR基因G719X变异检测仅能检测出其中的一种或两种变异形式。血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、ARMS-PCR)，仍难以准确而可靠地检测出肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者体内EGFRG719X基因变异的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述不足，本专利技术的目的是针对患者非肿瘤组织中EGFRG719X基因变异检测灵敏度低的缺陷，提出一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法。该方法以数字PCR为检测平台，针对EGFRG719X基因的三种变异形式(G719A、G719S、G719C)设计合成用于检测EGFRG719X基因变异上下游引物、EGFRG719X基因变异检测探针，通过数字PCR技术判断待测样品中是否含有EGFRG719X基因变异的模板和发生突变的模板含量。该方法对于检测非肿瘤组织中EGFRG719X基因变异灵敏度高，且可同时检测EGFRG719X基因三种变异形式。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了ddPCR技术检测EGFRG719X基因变异的引物和探针，EGFRG719X基因变异包括EGFRG719A基因变异、EGFRG719S基因变异和EGFRG719C基因变异，用于检测EGFRG719X基因变异的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测EGFRG719X基因变异的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，EGFRG719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，EGFRG719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，EGFRG719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，EGFRG719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。进一步地，所述EGFRG719A基因变异的检测探针、EGFRG719S基因变异的检测探针、EGFRG719C基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。本专利技术还提供了一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取受试者骨髓、外周血或组织的cfDNA；2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFRG719X基因变异的上下游引物、EGFRG719X基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；所述EGFRG719X基因变异包括EGFRG719A基因变异、EGFRG719S基因变异和EGFRG719C基因变异，用于检测EGFRG719X基因变异的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测EGFRG719X基因变异的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，EGFRG719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，EGFRG719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，EGFRG719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，，EGFRG719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；3)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有EGFRG719X基因变异的模板和发生突变的模板数量及含量。进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为0.3～2ng/μL。更进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为1ng/μL。进一步地，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为400～700nM，EGFRG719X基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针含量均为200～400nM。更进一步地，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为500nM，EGFRG719X基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针含量均为250nM。进一步地，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。更进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术的引物和探针的设计特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达到0.01％(即可以从1万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，避免产生假阴性结果；(2)且利用本专利技术设计合成的引物进行PCR扩增，扩增出来的片段仅为94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，因此可以从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用；(3)本方法可以一次检测EGFRG719X基因的三种变异形式(G719A、G719S、G719C)，操作过程更加简便，大大减少了临床检测成本及工作量本文档来自技高网...

【技术保护点】
ddPCR技术检测EGFR G719X基因变异的引物和探针，其特征在于，EGFR G719X基因变异包括EGFR G719A基因变异、EGFR G719S基因变异和EGFR G719C基因变异，用于检测EGFR G719X基因变异的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测EGFR G719X基因变异的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，EGFR G719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.ddPCR技术检测EGFRG719X基因变异的引物和探针，其特征在于，EGFRG719X基因变异包括EGFRG719A基因变异、EGFRG719S基因变异和EGFRG719C基因变异，用于检测EGFRG719X基因变异的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测EGFRG719X基因变异的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，EGFRG719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，EGFRG719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，EGFRG719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，EGFRG719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。2.根据权利要求1所述的ddPCR技术检测EGFRG719X基因变异的引物和探针，其特征在于，所述EGFRG719A基因变异的检测探针、EGFRG719S基因变异的检测探针、EGFRG719C基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。3.一种利用数字PCR技术检测EGFRG719X基因变异的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取受试者骨髓、外周血或组织的cfDNA；2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFRG719X基因变异的上下游引物、EGFRG719X基因变异的检测探针、EGFRG719X野生型的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；所述EGFRG719X基因变异包括EGFRG719A基因变异、EGFRG719S基因变异和EGFRG719C基因变异，用于检测EGFRG719X基因变异的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，用于检测EGFRG719X基因变异的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，EGFRG719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，EGFRG719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，EGFRG719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，，EGFRG719X野...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕昀，
申请(专利权)人：良培基因生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42