一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法技术

本发明专利技术提供一种较佳的用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，利用改进的较佳单细胞扩增方法对微量人类样本进行扩增，对扩增产物进行STR检测获得样本STR分型结果。相对于现有技术，该方法更高效、简单、实用、精准、污染小、损失少、成本低、方法重复性好、非常适合微量样本的应用，为法医及日常鉴定拓展了样本应用范围，同时提高了检测的精密度。

【技术实现步骤摘要】
一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法
本专利技术涉及法医学鉴定领域，尤其涉及一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法。
技术介绍
基因是DNA分子上携带有遗传信息的功能片断，是生物传递遗传信息的物质。DNA的使用日益广泛,特别是在刑事司法实践中，不断发展完善并在法庭科学领域发挥了巨大作用。法庭科学DNA数据库现已成为主流DNA数据库中涉及人员样本最广、也最为公众熟知的数据库。自从PCR技术应用到生物物证的检验，尤其是应用到STR基因座进行分析后，DNA提取便成为法医DNA多态性分析的关键环节，而DNA样品质量的好坏将直接关系到后续实验的成败。伴随高通量测序技术的快速发展，单核苷酸多态性(SNP)作为第三代遗传标记，越来越多的成为个体及亲子鉴定最新的检测手段。相对于STR，SNP在染色体中的分布更为广泛，数量更多，检测方法也更方便可靠。但这并不意味着二代测序技术能够即刻常规应用于法庭科学：第一，目前二代测序的成本较高，不能被法医学应用广泛接受；第二，二代测序平台都不可避免地存在一定比例的错误率，技术解决方案还未完全成熟完整，达不到DNA数据库引入要求；最后，二代测序解读规则尚未制定，不能应用于全国实验室数据共享范围。因此，对已有STR数据库的充分应用成为目前法医鉴定最经济实惠的检测方案。在实际检案中，越来越多的案件由于案件本身性质、作案过程或犯罪分子的反侦察意识增强等因素的作用，常规法医鉴定中难免会遇到微量样本，由于采样困难、样本降解等原因，使得DNA抽提困难从而达不到检测输入量而影响STR扩增鉴定。为了解决这一问题，本专利技术涉及一种针对微量样本的个体识别及亲子鉴定的方法，可将单细胞(pg，皮克)级的样本总量扩增至常规STR鉴定需要的纳克级(约150-150000个细胞DNA量)，整个流程无需纯化及转管即可进行STR鉴定，同时可以防止纯化及转管带来的样本损失或污染，从而使得样本损失更小，污染更少。如上所述，微量样本或单细胞DNA的数量极其微小，对其分析之前必须进行DNA的扩增。而现有技术中，以PCR(聚合酶链式反应)为基础的全基因组扩增技术，在PCR反应过程中，DNA片段的差异会影响聚合酶的扩增效率甚至导致酶滑链或者从模板上脱离，不能完整地覆盖基因组，并且会向序列中引入很多错误和非特异性扩增产物，存在扩增偏倚，在起始样本非常稀少时，使扩增质量大大降低，并且一次只能通过特定引物对单个基因位点进行检查，无法对同一样品进行多位点扩增和检测，无法进行单细胞全基因的分析。而新型的基于MDA(多重置换扩增)的扩增方法，在现有方法下也存在扩增偏倚量大、扩增质量不好、假阳性等现象。因此为解决单细胞扩增中扩增偏倚量大、扩增质量不好、假阳性等问题，本专利技术同时创造性地设计并采用特殊修饰引物，避免了非特异性扩增产生，同时利用平行样本分析方案，解决可能存在的等位基因缺失问题。简而言之，本专利技术提供了一种更好的高效、简单、实用、精准、污染小、损失少、成本低、方法重复性好、非常适合微量样本的应用的个体识别及亲子鉴定的方法，为法医及日常鉴定拓展了样本应用范围，同时提高了检测的精密度。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利旨在提供一种更佳的单细胞扩增的改进方法，旨在利用改进的单细胞扩增方法对微量样本进行扩增，通过对扩增产物进行STR检测从而获得样本STR分型结果。本专利技术创造性地将一种改进的较佳单细胞扩增方法对微量人类样本进行扩增，对扩增产物进行STR检测即可获得样本STR分型结果。流程为样本裂解(从样本中释放基因组DNA)-样本扩增(将得到的皮克级别DNA通过扩增方式富集为纳克甚至微克级)-STR鉴定(基因座位点扩增及毛细管电泳鉴定)，整个流程无需转管及纯化，2-3小时即可完成。比对参考序列即可得知样本与参考序列之间的关系鉴定结果。不仅仅是创造性地将一种改进的最佳单细胞扩增方法首次应用到微量样本，更重要的是创造性地设计并采用特殊修饰引物，避免了非特异性扩增产生，同时利用平行样本分析方案，解决可能存在的等位基因缺失问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供了一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，包括如下步骤：(1)样本裂解：向样本中加入细胞裂解液，使微量样本中的DNA释放，获取基因组DNA；进一步地，所述细胞裂解液PH＝14；进一步地，所述细胞裂解液包括但不限于以下一种或几种：0.2MNaOH+1％SDS、0.4MKOH+80mMDTT、400mMKOH+30mMEDTA+10mMDTT、300mMKOH+10mMEDTA等，最优的为300mMKOH+10mMEDTA；需要指出，可以是在进行步骤(2)之前，也可以采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由微量或单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。进一步地向经过步骤(1)处理后获得的细胞裂解液产物中加入中和液，进行样本中和；进一步地，所述中和液pH＝4；进一步地，所述中和液包括但不限于以下一种或几种：0.1M醋酸钠、0.1mMHCl、1MTris-HCl等，最优的为1MTris-HCl；(2)样本扩增：将经过步骤(1)处理后获得的产物中直接加入扩增缓冲液，使基因组DNA进行样本扩增；进一步地，所述扩增缓冲液包括：DNA聚合酶、BSA、随机引物、dNTP、DNA聚合酶、无核酸水；进一步地，所述DNA聚合酶buffer稀释至1乘；所述BSA为0.1～1mg/ml，优选地为0.2mg/m；所述随机引物为1～50μM，优选地为30μM；所述dNTP为0.2～1μM，优选地为0.6μM；所述DNA聚合酶为0.2～2U,优选地为0.4U；所述无核酸水(补齐至总体系50μl)进一步地，所述DNA聚合酶包括但不限于以下一种或几种：klenow片段(3′→5′exo-)、klenow片段、bstDNA聚合酶、ventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、ventDNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、deepventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、deepventDNA聚合酶；进一步地，所述随机引物为具有特殊修饰的引物，包括但不限于以下任一种：3’端的两个碱基进行硫代修饰，碱基组成可以是N5引物(N＝A/T/C/G)、D5引物(D＝A/G/T)、H5引物(H＝A/C/T)、R5引物(R＝A/G)、W5引物(W＝A/C)、M5引物(M＝A/C)、N6引物(N＝A/T/C/G)、D6引物(D＝A/G/T)、H6引物(H＝A/C/T)、R6引物(R＝A/G)、W6引物(W＝A/C)、M6引物(M＝A/C)、N7引物(N＝A/T/C/G)、D7引物(D＝A/G/T)、H7引物(H＝A/C/T)、R7引物(R＝A/G)、W7引物(W＝A/C)、M7引物(M＝A/C)等任意一种，最优的为W5、W6、W7引物；进一步地，所述随机引物的浓度为10-50μM，最优的为30μM；进一步地，所述样本扩增为等温扩增，在PCR仪上进行如下程序：30℃孵育1-6h，65℃孵育3minutes，4℃保存。优选地30℃孵育时间为3h。(3)STR鉴定：将经过步骤(2)处理获得的扩增产物进行STR基因座位点扩增及毛细管电泳鉴定；进一步地，所述STR基因座位点可采用多次平行样本位点进行总结分析，避免等位基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)样本裂解：向样本中加入细胞裂解液，使样本中的DNA释放，获取基因组DNA；(2)样本扩增：将经过步骤(1)处理后获得的产物中加入扩增缓冲液，使基因组DNA进行样本扩增；(3)STR鉴定：将经过步骤(2)处理获得的扩增产物进行STR基因座位点扩增及毛细管电泳鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)样本裂解：向样本中加入细胞裂解液，使样本中的DNA释放，获取基因组DNA；(2)样本扩增：将经过步骤(1)处理后获得的产物中加入扩增缓冲液，使基因组DNA进行样本扩增；(3)STR鉴定：将经过步骤(2)处理获得的扩增产物进行STR基因座位点扩增及毛细管电泳鉴定。2.如权利要求1所述的一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(1)中获取基因组DNA为已经由微量或单细胞样本裂解获得或由多细胞样本抽提获得的样本基因组DNA。3.如权利要求1所述的一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述扩增缓冲液包括：DNA聚合酶、BSA、随机引物、dNTP、DNA聚合酶、无核酸水。4.如权利要求3所述的一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶包括但不限于以下一种或几种：klenow片段(3′→5′exo-)、klenow片段、bstDNA聚合酶、ventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、ventDNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、deepventDNA聚合酶(3′→5′exo-)、deepventDNA聚合酶。5.如权利要求3所述的一种用于微量样本个体识别及亲子鉴定的方法，其特征在于，所述随机引物为具有特殊修饰的引物，包括但不限于以下任一种：3’端的两个碱基进行硫代修饰，碱基组成可以是N5引物(N＝A/T/C/G)、D5引物(D＝A/G/T...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静，李圣樱，陈昌岳，李明明，张培培，章申峰，谢玲，胡秋萍，张祥林，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31