本发明专利技术公开一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及其应用，包括如下步骤：提取大蒜叶片总RNA，qRT‑PCR法检测蔗糖1‑果糖基转移酶(1‑SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的表达量。该检测方法可以实现精确定量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，本发明专利技术还提供了所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及应用
属于分子生物技术和基因工程领域，涉及大蒜叶片果聚糖代谢关键酶基因的实时荧光定量PCR定量检测技术。
技术介绍
果聚糖是大蒜中含量最高的碳水化合物，被作为其收获产品的重要品质参数。研究证实，大蒜鳞茎中果聚糖含量极高，占其干物质质量的75～80％(Losso&Nakai,1997)。由于其聚合度大小的不同，可将果聚糖分为低聚果糖和高聚果糖。大蒜中的果聚糖以聚合度在3～9的低聚果糖为主，包括蔗果三糖、蔗果四糖、新蔗果三糖等(索慧，2010)。低聚果糖甜度高、热能低，能够促进肠道双歧杆菌增殖、抑制肠道有害细菌生长，具有极高的药用价值和保健功能(Bekersetal.,2004)。果聚糖作为大蒜中重要的贮存性物质，其代谢过程不仅影响着大蒜的产量和品质，还能够通过渗透调节增强植株在不良环境胁迫下的抗逆性(AbebeTetal.,2003；Pilon-SmitsEAHetal.,1995；RooverJDetal.,2003)。高等植物中，果聚糖的代谢受果聚糖合成酶与水解酶的共同影响(EdelmanJ&JeffordTG,1968)。果聚糖以蔗糖为底物，由蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)起始其合成(BLasseuretal.,2009)。果聚糖的降解主要受果聚糖外切水解酶(FEH)调控，它可将果聚糖分子上的末端糖基逐渐分离，最终被降解为蔗糖或单糖。研究发现，在多种环境胁迫下，果聚糖的代谢调控是植物适应不利环境的一种重要保护机制，其合成积累能够提高植物的抗逆性(ValluruR&VandenEndeW,2008)。近年来，大量学者已在小麦(马召朋，2014)、烟草(李慧娟等，2007)等植物中证实果聚糖能够调控干旱胁迫，但目前为止，关于干旱胁迫下大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达特征未见报道，果聚糖对干旱胁迫的响应及调控机制尚不明确。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。检测大蒜果聚糖代谢关键酶基因的表达，该检测方法可以实现精确定量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，本专利技术还提供了所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：提取大蒜叶片总RNA，qRT-PCR法检测蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的表达量。本专利技术还提供一种具体的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)大蒜叶片总RNA提取：大蒜苗高8-12cm时，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成对照样；大蒜苗不良环境胁迫6-8天后，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成待测样；分别提取对照样和待测样大蒜叶片总RNA，并合成cDNA；2)设计蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的特异性引物如下：1-SST引物对：F:TTTTTTTTTCCGACGGCTTC(如SEQIDNO.1所示)R:GGTACCAATGATCGGGAATA(如SEQIDNO.2所示)；1-FEH引物对：F:ATGGTCGAATGAATCGGATAG(如SEQIDNO.3所示)R:TGGCCATTGTACCAGAGTTT(如SEQIDNO.4所示)；3)选择5个大蒜基因：TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ做内参基因进行扩增；4)分别检测目的基因蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的差异表达：qRT-PCR分别检测对照样目的基因平均Ct值、对照样内参基因平均C值、待测样目的基因平均Ct值和待测样内参基因平均Ct值，根据△△Ct＝(△Ct待测样-△Ct对照样)＝(待测样目的基因平均Ct值-待测样内参基因平均Ct值)-(对照样目的基因平均Ct值-对照样内参基因平均Ct值)来计算目的基因的相对表达量；其中Ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，设定的阈值为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。进一步的，本专利技术内参基因TUA的特异性引物对：F:CCTAGAGCACGGTATTCAG(如SEQIDNO.5所示)R:GCGGTAAGTTCCAGTTCT(如SEQIDNO.6所示)。进一步的，本专利技术内参基因GAPDH的特异性引物对：F:AGGCTGGTGCTGATTACG(如SEQIDNO.7所示)R:GGTCTGAAGTGTATGAAGTATGG(如SEQIDNO.8所示)。进一步的，本专利技术内参基因ACT的特异性引物对：F:CAGGAGTTATGGTTGGAATGG(如SEQIDNO.9所示)R:AGCACGGGATGTTCTTCA(如SEQIDNO.10所示)。进一步的，本专利技术内参基因CYP的特异性引物对：F:AAGGACGAGAACTTCATC(如SEQIDNO.11所示)R:TCAATATCTCTCACCACTTC(如SEQIDNO.12所示)。进一步的，本专利技术内参基因UBQ的特异性引物对：F:AAGCCAAGATACAGGACAAG(如SEQIDNO.13所示)R:GCATACCACCTCTCAATCTC(如SEQIDNO.14所示)。本专利技术所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。当不良环境胁迫7天时，蔗糖1-果糖基转移酶基因相对表达量>1.5或果聚糖外切水解酶基因相对表达量>2.5时，表示为高糖抗逆品种。本专利技术所述一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，通过对大蒜叶片果聚糖代谢合成关键酶蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和降解关键酶果聚糖外切水解酶(FEH)基因表达量的检测，得到大蒜果聚糖响应干旱胁迫下的调控机制，可以此应用在大蒜高糖抗逆育种中。本专利技术从大蒜叶片总RNA提取、1-SST和1-FEH基因特异性引物设计与合成、内参基因的筛选、反转录产物cDNA的制备、qRT-PCR检测以及基因相对表达量的计算等方面，公布了1-SST和1-FEH基因表达定量检测的完善体系，能够准确、快速地定量干旱胁迫下大蒜代谢关键酶基因1-SST和1-FEH的差异表达，具有重要的应用价值。本专利技术的目的是提供大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。利用实时荧光定量PCR技术，通过所得Ct值利用法计算，快速、准确地定量检测了大蒜在干旱胁迫下果聚糖代谢关键酶基因的表达量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，这些是普通PCR无法实现的，该检测方法弥补了普通PCR技术的缺陷，实现了实时监测扩增反应，具有实时、准确、快速、可靠等优点。利用本专利技术建立的方法，不仅测定了大蒜在干旱胁迫下果聚糖代谢关键酶基因的差异表达量，而且由于其准确度高，可为大蒜高糖抗逆育种提供准确的理论参考。分析果聚糖在响应干旱胁迫中的作用，可为大蒜高糖抗逆育种提供理论参考。附图说明图1：RNA质量检测结果；图2：内参基因的PCR检测；图3：1-SST引物通用性普通PCR检测；图4：1-FEH引物通用性普通PCR检测；图5：CYP引物通用性普通PCR检测；图6：1-SST引物特异性荧光定量PCR检测；图7：1-FE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)大蒜叶片总RNA提取：大蒜苗高8‑12cm时，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成对照样；大蒜苗不良环境胁迫6‑8天后，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成待测样；分别提取对照样和待测样大蒜叶片总RNA，并合成cDNA；2)设计目的基因蔗糖1‑果糖基转移酶基因的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.1所示，R:如SEQ ID NO.2所示；设计目的基因果聚糖外切水解酶基因的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.3所示，R:如SEQ ID NO.4所示；3)选择5个大蒜基因：TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ做内参基因进行扩增；4)qRT‑PCR分别检测对照样目的基因平均Ct值、对照样内参基因平均Ct值、待测样目的基因平均Ct值和待测样内参基因平均Ct值，根据相对表达量＝
【技术特征摘要】
1.一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)大蒜叶片总RNA提取：大蒜苗高8-12cm时，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成对照样；大蒜苗不良环境胁迫6-8天后，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成待测样；分别提取对照样和待测样大蒜叶片总RNA，并合成cDNA；2)设计目的基因蔗糖1-果糖基转移酶基因的特异性引物对：F:如SEQIDNO.1所示，R:如SEQIDNO.2所示；设计目的基因果聚糖外切水解酶基因的特异性引物对：F:如SEQIDNO.3所示，R:如SEQIDNO.4所示；3)选择5个大蒜基因：TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ做内参基因进行扩增；4)qRT-PCR分别检测对照样目的基因平均Ct值、对照样内参基因平均Ct值、待测样目的基因平均Ct值和待测样内参基因平均Ct值，根据相对表达量＝△△Ct＝(△Ct待测样-△Ct对照样)＝(待测样目的基因平均Ct值-待测样内参基因平均Ct值)-(对照样目的基因平均Ct值-对照样内参基因平均Ct值)来计算目的基因的相对表达量；其中Ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，设定的阈值为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。2.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：田洁，边海燕，钟启文，王丽慧，杨世鹏，
申请(专利权)人：青海大学，青海省农林科学院，
类型：发明
国别省市：青海,63
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