本发明专利技术提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒，属于分子生物学技术领域。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术提供的引物适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出十二指肠钩虫，特异性达100％。本发明专利技术还提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，所述试剂盒方便准确地鉴定十二指肠钩虫的存在，仅需5～20min即可完成，无需通过高温使DNA解旋，在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。
【技术实现步骤摘要】
一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒。
技术介绍
十二指肠钩口线虫(Ancylostomaduodenale)，简称十二指肠钩虫，其成虫寄生在人体的小肠上段，以口囊内的钩齿咬附肠粘膜，以血液、淋巴液，脱落上皮细胞为食，虫体有不断更换咬咐部位的特点。由于机械性损伤，引起消化功能紊乱、患者出现腹部不适、腹痛、恶心、呕吐、腹胀、腹泻等症状，使患者长期慢性失血而导致贫血。钩虫病呈全球性分布，约7亿人感染，已成为非常严重的公共卫生问题。我国也是钩虫病流行较严重的国家，据2004年第二次全国人体重要寄生虫病现状调查显示，我国钩虫感染率为6.12％，感染人数高达3930万，并且这个数据没有减缓的迹象。目前检测钩虫病的技术包括病原学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术。钩虫病的病原学检测技术主要采用幼虫培养，虫卵检查和成虫检验等，最常用的方法是虫卵检查，Tarafder等人利用虫卵检查方法检测5624份人粪便样本钩虫感染情况，该方法费时费力且需要专业经验，准确率也低，存在漏检问题(EstimatingthesensitivityandspecificityofKato-Katzstoolexaminationtechniquefordetectionofhookworms,Ascarislumbricoides,andTrichuristrichiura,infectionsinhumansintheabsenceofa‘goldstandard’[J].InternationalJournalforParasitology,2010,40(4):399-404)。酶联免疫沉淀技术是研究蛋白质间相互作用，其原理是将蛋白质视为抗原，并于抗体特异性结合，最终从成千上万种蛋白质中分离出指定蛋白质。Quinnell等人利用该技术分析鉴定美洲钩虫，这种酶联免疫法存在灵敏度低的问题，检出率受到限制(Theimmunoepidemiologyofhumanhookworminfection.[J].ParasiteImmunology,2004,26(11‐12):443-454)。分子生物学检测技术主要是实时荧光定量PCR技术又称RT-PCR，其原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。这种方法灵敏、特异、检出率高，但对人员要求及设备要求高，检测时间1.5～2小时。LAMP技术是一种全新高效的基因诊断技术，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，运用一种具有链置换活性的DNA聚合酶在65℃恒温条件下通过自动循环的链置换DNA合成过程，反应约60min即可实现对靶DNA的扩增，但存在假阳性高，引物探针设计复杂，不容易设计等问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的钩虫检测方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，还包括探针和上述方案所述的引物；所述探针具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。优选的，所述探针采用修饰基团进行修饰；所述修饰基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数32bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基位置。优选的，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。优选的，所述引物中上游引物和下游引物的浓度独立为0.05～0.1mmol/L。优选的，所述探针的浓度为0.02～0.05mmol/L。优选的，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为500mmol/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为250mmol/L的MgAc和质量分数为20％的PEG6000。优选的，所述阳性质控品中含有十二指肠钩虫的基因组DNA；所述十二指肠钩虫的基因组DNA的浓度为1×106IU/mL。优选的，所述临界阳性质控品中含有十二指肠钩虫的基因组DNA；所述十二指肠钩虫的基因组DNA的浓度为1×103IU/mL。优选的，所述阴性质控品为为ddH2O或纯化水。本专利技术提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本专利技术提供的引物适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出十二指肠钩虫，特异性达100％。本专利技术还提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，所述试剂盒方便准确地鉴定十二指肠钩虫的存在，操作简便，检测时间短，仅需5～20min即可完成，无需通过高温使DNA解旋，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。所述检测方法快速、高通量，降低了鉴别时间和检测成本，研究表明本专利技术提供的基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，具有特异性强的特点，特异性达100％，灵敏度为102IU/mL。同时，本专利技术提供的基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。附图说明图1为不同浓度标准DNA的检测结果；图2为十二指肠钩虫样本DNA的检测结果；图3为十二指肠钩虫的特异性检测结果。具体实施方式本专利技术提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本专利技术中，选择钩虫的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得十二指肠钩虫5.8SrRNA基因序列，并进行多序列比对，从中选出一段保守序列，该序列如序列表中SEQIDNO.4所示：CCTTACTGCTTGTGTTGGTGGTTGAGCATTAGGCTAACGCCTGATGCGGCACCTGTCTGTCAGGAAACCTTAATGATCTGCTAACGCGGACGCCAGTACAGCAATAACTTTTWAMGTTTAATGTTTGCAGAATCGTGACTTTATGTCACAATCGACTAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTAGCTGCGTTATTTACCACGAATTGCAGACGCTTAGAGTGGTGAAATTTTGAACGCATAGCGCCGTTGGGTTTTCCCTTCGGCACGTCTGGTTCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。2.一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的试剂盒，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品，其特征在于，还包括探针和权利要求1所述的引物；所述探针具有如序列表中SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针采用修饰基团进行修饰；所述修饰基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数32bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔3个碱基位置。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴洋，王晓婷，倪碧娴，茅范贞，曹俊，郭利川，刘燕红，王智宏，应清界，
申请(专利权)人：江苏省血吸虫病防治研究所，江苏奇天基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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