一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法技术

技术编号:17770425 阅读:48 留言:0更新日期:2018-04-21 23:07
本案提供了一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法,主要包括对乳制品的预处理、提取待测样品中DNA模板、配制LAMP扩增反应液、LAMP扩增及检测等步骤;其中在LAMP扩增反应液中加入了曙红和2‑羟基‑3‑萘甲酸,使得阳性扩增产物表现出特异的荧光反应,从而确定了沙门氏菌的存在;本发明专利技术所涉及的对乳制品中沙门氏菌的检测方法简单省时、准确度高、灵敏度高,从对乳制品的预处理到得到最终检测结果能够仅需要3‑3.5小时,极大的提高了被检乳制品的新鲜度和货架期,通过本发明专利技术所述方法检测出的结果与按照GB 4789.4‑2016中步骤检测出的结果的阳性符合率达到99.9%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法
本专利技术涉及微生物检验,具体涉及一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法。
技术介绍
在食品安全问题日益多元化的今天,占人类食品中特殊地位的乳及乳制品的安全性一直是社会和科学研究关注的焦点。乳制品营养丰富、搭配均衡,是一种经济实惠的优质蛋白,我国是乳制品消费大国,也是世界第三大乳制品生产国。然而,乳制品极易遭受致病菌污染,常见的污染乳制品的食源性致病菌有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等,其进入人体内后会造成腹泻、呕吐、急性肠胃炎等病症,严重的会危及生命。其中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是乳品检测最普遍的项目。沙门氏菌是生乳及乳制品中比较常见的一种食源性致病菌,受其感染的人和动物会出现伤寒、副伤寒等病症,沙门氏菌一旦进入血液组织,则会导致系统性炎症,甚至死亡。对于一个中等规模的乳品工厂,一天生产的不同类产品至少有上百个批次,加工过程中的原料、过程品、终产品、生产环境都需要进行沙门氏菌检测。根据GB4789.1-2016规定同一批次需采集5个样品进行检测,检测量每天高达几百个。根据GB4789.4-2016中要求,沙门氏菌的定性定判至少需要3天,该方法操作较繁琐、耗时长,不能满足检测时效的需求。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处,本专利技术的目的在于提供一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法。本专利技术的技术方案概述如下:(1)预处理:将待检测的乳制品加入含有二乙酰胺四乙酸钠和葡萄糖苷的溶液中,在40-42℃下水浴50-60分钟;(2)提取待测样品中DNA模板:将步骤(1)中水浴后的混合溶液过滤,并用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌,然后离心洗脱液,弃去上清液,向沉淀物中加入1-1.2mL的TE缓冲溶液,震荡使沉淀物悬浮,再次离心并弃去上清液,用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品中DNA;(3)配制LAMP扩增反应液:3μL的10×ThermoPol反应缓冲溶液、1μL浓度为1.6mM的dNTP、2μL浓度为25μM的FIP引物、2μL浓度为25μM的BIP引物、1μL浓度为25μM的F3引物、1μL浓度为25μM的B3引物、0.8μL的Bst聚合酶、8μL的待测样品DNA、2μL浓度为1.2mM的曙红、2μL浓度为1mM的2-羟基-3-萘甲酸、7.2μL灭菌超纯水;其中,所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物分别为沙门氏菌invA基因的LAMP检测引物中的前内引物、后内引物、前外引物、后外引物;(4)LAMP扩增及检测:将步骤(3)配制的扩增反应液在65℃恒温反应45-50分钟,进行荧光显色检测;当LAMP扩增反应液由褐色变为黄绿色荧光时,具有阳性扩增;当LAMP扩增反应液无颜色变化时,不具有阳性扩增。优选的是,步骤(1)中所述的溶液中二乙酰胺四乙酸钠的质量浓度为40-50wt%,葡萄糖苷的质量浓度为20-25wt%。优选的是,步骤(1)中所述乳制品、二乙酰胺四乙酸钠、葡萄糖苷三者的质量比为1∶4-5∶2-2.5。优选的是,步骤(2)中所述过滤采用无菌操作。优选的是,步骤(2)中所述的离心为在12000rpm转速下离心5分钟。优选的是,步骤(3)中所述FIP引物的序列组成是5’-GCGCCGCTACGCACTCTATATGTAGCTGCTACGCACGG-3’;BIP引物的序列组成是5’-GAACGGTGAAGCTTACGGGACGTCACTCGGTCATAGGAA-3’;F3引物的序列组成是5’-GAACATGCTGCAGATGTC-3’;B3引物的序列组成是5’-CGGCATTAGCGACTCCTT-3’。优选的是,步骤(4)中所述荧光显色检测采用IQTN5荧光定量PCR仪光学系统。对本专利技术及其有益效果的阐述:本专利技术所涉及的对乳制品中沙门氏菌的检测方法简单省时、准确度高、灵敏度高,从对乳制品的预处理到得到最终检测结果能够仅需要3-3.5小时,极大的提高了被检乳制品的新鲜度和货架期,通过本专利技术所述方法检测出的结果与按照GB4789.4-2016中步骤检测出的结果的阳性符合率达到99.9%以上;首先,本方法中将待检乳制品用含有二乙酰胺四乙酸钠(EDTTI-Na)和葡萄糖苷(APG)的溶液进行了预处理,EDTTI-Na的结构与EDTA近似,用酰胺基取代了EDTA中的胺基,增加了分子量,从而提高了螯合能力,能与钙离子形成稳定的六圆环螯合物,EDTTI-Na在APG的辅助作用下,夺取乳制品酪蛋白胶束中的钙离子、分解体系中的大分子蛋白聚合物,使酪蛋白胶束解离成小分子酪蛋白单体、蛋白聚合物解离成短肽链,克服蛋白胶束或者聚合物在真空快速过滤富集过程中的阻遏作用,从而能够迅速富集所要检测样品,即含有沙门氏菌等的菌体。然后,在配制LAMP扩增反应液时,(1)以美国基因序列数据库(GeneBank)中GeneBank号为M90846的沙门氏菌invA基因作为靶基因,设计出其LAMP扩增的两对最佳引物,即内引物(FIP、BIP)和外引物(F3、B3),对靶基因进行扩增时,特异性强,能够准确排出其他生理生化相似的肠杆菌科细菌的干扰,对多种不同血清型沙门氏菌均能有效扩增;(2)在反应液中加入了荧光显色反应试剂,曙红和2-羟基-3-萘甲酸,两者在单独使用时没有针对沙门氏菌靶基因扩增产物的特异性荧光显色效果,当按照本专利技术所述的比例添加时,对沙门氏菌invA基因的阴性及阳性反应具有明显的颜色区分,可据此准确判断结果,即当LAMP扩增反应液由褐色变为黄绿色荧光时,具有阳性扩增,意味着样品中存在沙门氏菌污染;当LAMP扩增反应液无颜色变化时,不具有阳性扩增,说明样品中不存在沙门氏菌污染。最后,本专利技术所涉及的荧光检测沙门氏菌的灵敏度高,较常用的PCR电泳检测灵敏度提高了10倍以上,而且操作简便,对靶基因的富集效率高,在半小时的扩增时间中足以达到能够检测的限度。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术提供了一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法,通过下述实施例具体阐述。实施例1(1)预处理:将1重量份的待检测的牛乳加入10重量份的含有50wt%二乙酰胺四乙酸钠和25wt%葡萄糖苷的溶液中,在40-42℃下水浴50-60分钟;(2)提取待测样品中DNA模板:将步骤(1)中水浴后的混合溶液无菌真空抽滤,并用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌,然后以12000rpm离心洗脱液5分钟,弃去上清液,向沉淀物中加入1.2mL的TE缓冲溶液,震荡使沉淀物悬浮,再次离心并弃去上清液,用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品中DNA;(3)配制LAMP扩增反应液:3μL的10×ThermoPol反应缓冲溶液、1μL浓度为1.6mM的dNTP、2μL浓度为25μM的FIP引物、2μL浓度为25μM的BIP引物、1μL浓度为25μM的F3引物、1μL浓度为25μM的B3引物、0.8μL的Bst聚合酶、8μL的待测样品DNA、2μL浓度为1.2mM的曙红、2μL浓度为1mM的2-羟基-3-萘甲酸、7.2μL灭菌超纯水;其中,所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物的序列组成如前文所述;(4)LAMP扩增及检测:将步骤(3)配制的扩增反应液在65℃恒温反应4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法,其特征在于,包括下述步骤:(1)预处理:将待检测的乳制品加入含有二乙酰胺四乙酸钠和葡萄糖苷的溶液中,在40‑42℃下水浴50‑60分钟;(2)提取待测样品中DNA模板:将步骤(1)中水浴后的混合溶液过滤,并用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌,然后离心洗脱液,弃去上清液,向沉淀物中加入1‑1.2mL的TE缓冲溶液,震荡使沉淀物悬浮,再次离心并弃去上清液,用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品中DNA;(3)配制LAMP扩增反应液:3μL的10×ThermoPol反应缓冲溶液、1μL浓度为1.6mM的dNTP、2μL浓度为25μM的FIP引物、2μL浓度为25μM的BIP引物、1μL浓度为25μM的F3引物、1μL浓度为25μM的B3引物、0.8μL的Bst聚合酶、8μL的待测样品DNA、2μL浓度为1.2mM的曙红、2μL浓度为1mM的2‑羟基‑3‑萘甲酸、7.2μL灭菌超纯水;其中,所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物分别为沙门氏菌invA基因的LAMP检测引物中的前内引物、后内引物、前外引物、后外引物;(4)LAMP扩增及检测:将步骤(3)配制的扩增反应液在65℃恒温反应45‑50分钟,进行荧光显色检测;当LAMP扩增反应液由褐色变为黄绿色荧光时,具有阳性扩增;当LAMP扩增反应液无颜色变化时,不具有阳性扩增。...

【技术特征摘要】
1.一种乳制品中沙门氏菌的快速检测方法,其特征在于,包括下述步骤:(1)预处理:将待检测的乳制品加入含有二乙酰胺四乙酸钠和葡萄糖苷的溶液中,在40-42℃下水浴50-60分钟;(2)提取待测样品中DNA模板:将步骤(1)中水浴后的混合溶液过滤,并用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌,然后离心洗脱液,弃去上清液,向沉淀物中加入1-1.2mL的TE缓冲溶液,震荡使沉淀物悬浮,再次离心并弃去上清液,用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品中DNA;(3)配制LAMP扩增反应液:3μL的10×ThermoPol反应缓冲溶液、1μL浓度为1.6mM的dNTP、2μL浓度为25μM的FIP引物、2μL浓度为25μM的BIP引物、1μL浓度为25μM的F3引物、1μL浓度为25μM的B3引物、0.8μL的Bst聚合酶、8μL的待测样品DNA、2μL浓度为1.2mM的曙红、2μL浓度为1mM的2-羟基-3-萘甲酸、7.2μL灭菌超纯水;其中,所述FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物分别为沙门氏菌invA基因的LAMP检测引物中的前内引物、后内引物、前外引物、后外引物;(4)LAMP扩增及检测:将步骤(3)配制的扩增反应液在65℃恒温反应45-50分钟,进行荧光显色检测;当LAMP扩增反应液由褐...

【专利技术属性】
技术研发人员:王文文张海涛史寒琴
申请(专利权)人:新希望双喜乳业苏州有限公司
类型:发明
国别省市:江苏,32

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