一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法技术

技术编号:17770405 阅读:32 留言:0更新日期:2018-04-21 23:07
本发明专利技术公开一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,该仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法包括如下步骤:体外培养猪小肠细胞IPEC‑1;在猪小肠细胞IPEC‑1的培养基中添加候选营养物质,并实时观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标;根据细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标,从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。本发明专利技术旨在提供一种对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法。

【技术实现步骤摘要】
一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法
本专利技术涉及生物
,特别涉及一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法。
技术介绍
长期以来,饲料中添加抗生素类促生长剂给人类提供了大量而经济的畜禽产品,但也产生了耐药性和残留问题,严重影响到生态环境和食品安全。当前饲料业和养殖业发展中面临的一个重要难题是如何在不影响饲料产品应用效果和猪禽养殖生产效率的同时,减少饲料中抗生素的使用。寻找安全高效的饲料添加剂来替代饲用抗生素,是我国饲料业和养殖业迫切需要解决的重大科技问题。当前,饲料添加剂便捷的筛选方法比较缺乏,经常出现候选营养物质未经筛选就直接进行动物试验的情况,往往因试验效果不佳,造成人力物力的极大浪费。传统的筛选方法有体外抑菌试验、体外细胞生长试验等,缺乏实时监测和细胞相关功能的分析,不能准确评定候选营养物质的效果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,旨在提供一种对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法。为实现上述目的,本专利技术提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,包括如下步骤:体外培养猪小肠细胞IPEC-1;在猪小肠细胞IPEC-1的培养基中添加候选营养物质,并观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标;根据细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标,从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。优选的,所述在猪小肠细胞IPEC-1的培养基中添加候选营养物质,并观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标的步骤,具体包括如下步骤:在载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测细胞生长状态;在载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标。优选的,所述在载有猪小肠细胞系IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测细胞生长状态的步骤,具体包括如下步骤:将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液;在孔板的每孔中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养;在每孔内加入所述细胞悬液进行培养,并观测细胞生长状态;在每孔内加入含候选营养物质的基础培养基进行培养,并观测细胞生长状态。优选的,所述将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液的步骤,具体包括:将载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散;再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化;对终止消化后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基在室温下离心,离心转速为1000rpm,离心时间为5分钟;将离心后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中的上清液吸除;用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将猪小肠细胞IPEC-1的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液。优选的,所述在孔板的每孔中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养的步骤,具体包括:在孔板的每孔中加入150μl含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,培养12h。优选的,所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养,并实时观测细胞生长状态的步骤中,所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养具体包括:在每孔内加入300μl所述细胞悬液进行培养,培养24h。优选的,所述在载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标的步骤,具体包括如下步骤:将猪小肠细胞的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液;在孔板的每孔中加入所述细胞悬液进行培养,确保猪小肠细胞IPEC-1贴壁;在孔板的每孔吸出部分培养基并加入pH为7.4的检测液进行培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率OCR;加入候选营养物质培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率OCR;加入寡霉素A培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率OCR;加入解偶联剂FCCP培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率OCR;加入鱼藤酮/抗霉素A培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率OCR;计算细胞线粒体呼吸功能指标值。优选的,所述将猪小肠细胞的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液的步骤,具体包括:将载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散;再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化;对终止消化后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基在室温下离心,离心转速为1000rpm,离心时间为5分钟;将离心后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中的上清液吸除;用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将猪小肠细胞IPEC-1的浓度调至1.2×105个/ml的细胞悬液。优选的,所述在孔板的每孔吸出部分培养基并加入pH为7.4的检测液进行培养,检测此时猪小肠细胞系IPEC-1的呼吸耗养率的步骤中,所述检测液为含5mM葡萄糖、0mM谷氨酰胺、0mM丙酮酸钠的基础培养基。优选的,所述计算细胞线粒体呼吸功能指标值的步骤中,计算方法包括:基础呼吸率OCR=加入候选营养物质后OCR的平均值;ATP产生=基础呼吸率OCR-加入寡霉素A后的OCR平均值;质子漏=加入寡霉素A后的OCR平均值-加入鱼藤酮/抗霉素A后的OCR平均值;最大呼吸率=加入FCCP后的OCR平均值;备用呼吸率=最大呼吸率OCR平均值-基础呼吸率OCR平均值。本专利技术提供的一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,具有以下优点:通过体外培养猪小肠细胞IPEC-1,监测猪小肠细胞IPEC-1实时生长数据和线粒体呼吸功能,建立一种促进仔猪肠道细胞生长、改善肠道细胞线粒体呼吸功能的功能性饲料添加剂方法;对细胞实时监测、结合细胞线粒体呼吸代谢功能为评定指标的功能性饲料添加剂的筛选方法,具有速度快、准确性高、重复性好等特点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为实施例1中谷氨酰胺(Gln)对猪小肠细胞IPEC-1生长影响的实时分析结果图;图2为实施例2中谷氨酰胺(Gln)对猪小肠细胞IPEC-1线粒体呼吸功能的影响的分析结果图;图3为实施例1中链脂肪酸酯对猪小肠细胞IPEC-1生长影响的实时分析结果图;图4为实施例2中链脂肪酸酯对猪小肠细胞IPEC-1线粒体呼吸功能的影响的分析结果图。本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提出一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,所述仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法包括如下步骤:步骤S100,体外培养猪小肠细胞IPEC-1。小肠上皮细胞(i本文档来自技高网...
一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法

【技术保护点】
一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:体外培养猪小肠细胞IPEC‑1;在猪小肠细胞IPEC‑1的培养基中添加候选营养物质,并实时观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标;根据实时细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标,从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。

【技术特征摘要】
1.一种仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:体外培养猪小肠细胞IPEC-1;在猪小肠细胞IPEC-1的培养基中添加候选营养物质,并实时观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标;根据实时细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标,从候选营养物质筛选出仔猪功能性饲料添加剂。2.如权利要求1所述的仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,所述在猪小肠细胞IPEC-1的培养基中添加候选营养物质,并实时观测细胞生长状态以及细胞线粒体呼吸功能指标的步骤,具体包括如下步骤:在载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测细胞生长状态;在载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,观测并计算出细胞线粒体呼吸功能指标。3.如权利要求2所述的仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,所述在载有猪小肠细胞系IPEC-1的DMEM/F12培养基中,加入候选营养物质培养,实时观测细胞生长状态的步骤,具体包括如下步骤:将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液;在孔板的每孔中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养;在每孔内加入所述细胞悬液进行培养,并观测细胞生长状态;在每孔内加入含候选营养物质的基础培养基进行培养,并观测细胞生长状态。4.如权利要求3所述的仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,所述将猪小肠细胞的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液的步骤,具体包括:将载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基加入胰蛋白酶进行消化至细胞分散;再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化;对终止消化后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基在室温下离心,离心转速为1000rpm,离心时间为5分钟;将离心后的载有猪小肠细胞IPEC-1的DMEM/F12培养基中的上清液吸除;用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将猪小肠细胞IPEC-1的浓度调至1×105个/ml的细胞悬液。5.如权利要求3所述的仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,所述在孔板的每孔中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养的步骤,具体包括:在孔板的每孔中加入150μl含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,培养12h。6.如权利要求5所述的仔猪功能性饲料添加剂的筛选方法,其特征在于,所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培养,并观测细胞生长状态的步骤中,所述在每孔内加入所述细胞悬液进行培...

【专利技术属性】
技术研发人员:易丹侯永清丁斌鹰吴涛
申请(专利权)人:武汉轻工大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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