一种三酶系统制备7‑氨基头孢烷酸的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种三酶系统制备7‑氨基头孢烷酸的方法。将头孢菌素C作为底物，在反应器中加入固定化D‑氨基酸氧化酶和细胞酶液(含有戊二酰‑7‑氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶)，通入氧气，调节pH和控制温度搅拌反应，一步法制备7‑氨基头孢烷酸。本发明专利技术的操作过程简单，各参数容易调控，而且反应过程中，由于过氧化氢酶的存在，会分解反应产生的H2O2，避免H2O2对反应体系酶催化剂的失活影响以及对底物、中间产物的降解影响，显著提高了酶催化剂的使用寿命，可有效地降低7‑氨基头孢烷酸的生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法
本专利技术属于药品生产领域，具体涉及药品中间体7-氨基头孢烷酸的三酶系统制备方法。
技术介绍
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanicacid)是头孢菌素C的母核，是生产临床半合成头孢菌素类抗生素的关键原料，在7-氨基头孢烷酸的两个活性基团3-位的乙酰氧基和7-位的氨基连接上不同的侧链，就构成了不同的头孢类抗生素产品，如头孢曲松钠、头孢呋辛钠等。随着半合成头孢菌素类抗生素在医学上的广泛运用，7-氨基头孢烷酸的需求量也在日益扩大，国际竞争也益发激烈，如何环保并经济有效地裂解头孢菌素C获取7-氨基头孢烷酸，进一步降低其生产成本，提高其国际竞争力是我国当前民族医药发展亟需解决的关键问题。长期以来国内企业主要通过化学裂解法生产7-氨基头孢烷酸，然而化学裂解头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸存在严重的能耗成本与治污成本问题，目前正逐步被酶裂解法所取代。酶裂解法具有生产工艺简单、环境污染少和生产条件温和等优势。目前国内已经有多家企业使用两步酶法生产7-氨基头孢烷酸，获得巨大的经济效益。但该工艺需要涉及到2～3个的反应器。随着7-氨基头孢烷酸产品日益严峻的国际竞争压力，为缩短生产工艺以进一步降低7-氨基头孢烷酸的生产成本，人们对一步法生产7-氨基头孢烷酸(单罐生产法)的研究变得极为关注。目前所报道的一步法工艺包括两个方面：第一、单酶一步法：通过一种单酶(头孢菌素C酰化酶)转化头孢菌素C生产7-氨基头孢烷酸。虽然投入了大量资源从事多年的研究，然而至今获得的头孢菌素C酰化酶存在酶活力低等问题，还无法满足工业化生产的要求，而通过基因克隆技术还无法实现该酶活力有实质性的提高(该酶基因结构较复杂)。第二、双酶一步法：先利用D-氨基酸氧化酶在一定的条件下将头孢菌素C氧化脱氨，生成α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)和H2O2，α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸这个中间体很不稳定，容易被体系中生成或另外加入的H2O2氧化脱羧生成戊二酰-7-氨基头孢烷酸和戊二酸。戊二酰-7-氨基头孢烷酸这个中间体在戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的作用下脱去侧链生成7-氨基头孢烷酸。该工艺需要在D-氨基酸氧化酶的催化反应液中加入H2O2，由于H2O2对反应液中的底物与产物都有很强的氧化裂解作用，造成终产物中有较多的副产物生成，使得酶催化剂的稳定性受到严重影响。
技术实现思路
本专利技术针对现有生产工艺生产成本高、工艺复杂、产率低和酶活力低等问题，提供了一种三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法。其采用头孢菌素C作为底物，加入固定化D-氨基酸氧化酶、戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶进行催化反应。使得反应过程中，由于过氧化氢酶的存在，分解反应产生的H2O2，避免H2O2对反应体系酶催化剂的失活影响以及对底物、中间产物的降解影响，显著提高了酶催化剂的使用寿命，可有效地降低7-氨基头孢烷酸的生产成本，而且该生产过程操作简单。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，将头孢菌素C溶液加入到酶反应器中，再加入D-氨基酸氧化酶、内含戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶的细胞酶液，通入氧气(通气量为0.1～0.5L/min)，控制温度在25～30℃，调节pH至7.0-8.0，采用高效液相色谱实时监测，搅拌反应至反应终点。本专利技术中的细胞酶液含20～75U/g的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和超过30U/g的过氧化氢酶。细胞酶液是细菌细胞是经过冻融处理，或透性化处理，或固定化处理得到的，戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶共表达在一株细菌细胞中。冻融处理是将细菌细胞冷冻后，再拿出自然解冻获得；透性处理是将CTAB、尿素、TritonX-100、丙酮等有机溶剂处理细胞获得；固定化处理是将戊二醛或戊二醛活化获得琼脂糖、乙二醛琼脂糖、溴化氰活化的琼脂糖等处理细胞获得；本专利技术中D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶投入量比例为1:1。本专利技术中的头孢菌素C溶液是使用0.1mol/LpH7.5的磷酸盐缓冲液配置的。当头孢菌素C的转化率达到95％以上或7-氨基头孢烷酸的生产率无变化时，停止反应。作为技术方案的优选，所述底物与投酶量为：1克头孢菌素C：20-50UD-氨基酸氧化酶：20-50U戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶：30～2000U过氧化氢酶。由于过氧化氢酶检测方法不同，因此活力的数据差异较大。作为技术方案的优选，酶催化过程中反应器的温度控制在28℃，饱和碳酸钠溶液调节pH至7.5。作为技术方案的优选，酶催化过程中氧气的通入量为0.2L/min。作为技术方案的优选，反应过程中，当头孢菌素C的转化率达到95％以上，7-氨基头孢烷酸的生产率无变化时，停止反应。与现有技术相比，本专利技术优势之处在于：(1)本专利技术是采用三酶一步法制备7-氨基头孢烷酸的方法。在该反应体系中，由于过氧化氢酶的存在，会分解体系中生成的H202，避免了当前流行的双酶法工艺路线中H2O2对反应体系酶催化剂的失活影响及其对底物、中间产物的降解影响，这可以显著地提高酶催化剂的使用寿命，可有效地降低7-氨基头孢烷酸的生产成本。(2)本专利技术中的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶共同表达在细菌细胞中，而D-氨基酸氧化酶是采用载体固定化，这样反应体系包括两种不同形式的酶催化剂。既然该反应体系中两种酶催化剂形式不同，可单独分离的，在连续催化反应中，可以选择性地分离并丢掉任何一个酶活力已经损失的催化剂，或补料添加损失的酶活，做到有策略地避免另一个仍可用酶催化剂的浪费。(3)本专利技术的反应体系中两种酶活力的比例可以调节到一个最佳值，从而能够获得一个满意的底物转化速率或产物生成速率。(4)本专利技术的反应体系直接利用细胞的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶，可以避免这两种酶进一步的分离、纯化及固定化等繁琐的操作过程而造成成本上升的问题。酶催化剂的成本降低，导致7-氨基头孢烷酸的生产成本下降。具体实施方式本专利技术用下列实施例进行说明，但不是对本专利技术的使用范围的限制。实施例1头孢菌素C溶液配置：称取0.5g头孢菌素C，加入50mL0.1MpH7.5的磷酸盐缓冲液，即得到浓度是1％的头孢菌素C溶液。三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，将1％头孢菌素C溶液加入到酶反应器中，再加入40U固定化D-氨基酸氧化酶、内含40U戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和50U过氧化氢酶的细胞酶液，通入氧气(通气量为0.2L/min)，液相色谱实时监测，每10分钟测定一次反应进程。每20min取1mL上清液，12000rpm离心10min后，再取上清液用于HPLC分析。反应过程中头孢菌素C的转化率达到98％以上停止反应。细胞酶液是戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶共表达在一株细菌细胞中，然后经过冻融处理。实施例2头孢菌素C溶液配置：称取2g头孢菌素C，加入100mL0.1MpH7.5的磷酸钠盐缓冲液，充分溶解后，即得到浓度是2％的头孢菌素C溶液。三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，将2％头孢菌素C溶液加入到酶反应器中，再加入90U固定化D-氨基酸氧化酶、内含90U戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和70U过氧化氢酶的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三酶系统制备7‑氨基头孢烷酸的方法，其特征在于：将头孢菌素C溶液加入到酶反应器中，再加入D‑氨基酸氧化酶、内含戊二酰‑7‑氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶的细胞酶液，通入氧气，控制温度在25～30℃，调节pH至7.0‑8.0，搅拌反应至反应终点。

【技术特征摘要】
1.一种三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于：将头孢菌素C溶液加入到酶反应器中，再加入D-氨基酸氧化酶、内含戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和过氧化氢酶的细胞酶液，通入氧气，控制温度在25～30℃，调节pH至7.0-8.0，搅拌反应至反应终点。2.根据权利要求1所述的三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于：所述细胞酶液采用冻融，透性化处理或细胞固定化而得，其中含20～75U/g的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和超过30U/g的过氧化氢酶。3.根据权利要求2所述的三酶系统制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于：头孢菌素C、D-氨基酸氧化酶、酰化酶和过氧化氢酶的比例为1克：20-50U：20-50U：30～2000U。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭强，邱杰，罗湘，谢文佩，袁晶，凌泽农，廖夏云，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：广西,45