一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法技术

本发明专利技术属于生物发酵技术领域，特别是利用高密度发酵规模化生产TRIM72蛋白的方法。本发明专利技术利用大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72经过试管斜面活化、摇瓶培养、种子罐扩大培养制备种子液、发酵罐高密度发酵等工艺步骤发酵生产TRIM72蛋白。本发明专利技术采用的高密度发酵方法，解决了TRIM72蛋白发酵菌体量少、表达产量低、难以工业化大规模生产的问题；能显著提高大肠杆菌发酵密度，增加单位菌体蛋白表达量，从而提高TRIM72蛋白表达总量，具有减少试剂消耗、节约成本、操作简单、重复性好的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法
本专利技术属于生物发酵
，特别是利用高密度发酵重组大肠杆菌制备人骨骼肌TRIM72重组蛋白的方法。
技术介绍
TRIM72蛋白共有477个氨基酸，分子量为53kD，因最初在骨骼肌细胞中发现所以也叫做mitsu-gumin53(M653)，是一种肌肉特异性tripartitemotiffamily(TRIM)家族蛋白(该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别称为RING，B-BOX和卷曲结构域。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白带上泛素标记以便降解)，也是一种细胞膜修复机制的重要组成部分。在医学应用方面，TRIM72具有治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效，能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加TRIM72的含量保护心脏损伤，可用于治疗心脏缺血或再灌损伤，也有报道可以用于治疗胰岛素抵抗和II型糖尿病及其相关病症。但目前通过已知的人源野生型TRIM72蛋白表达基因，通过体外原核细胞蛋白表达体系无法获得更高的蛋白产量，所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的生产成本，特别是在同样的纯化技术条件下。为了提高细菌发酵菌体生长密度和目标产物的表达总量，提高发酵产物的比生产率，进一步降低生产成本，我们开发出了一种高密度发酵生产TRIM72蛋白的方法。本专利技术显著提高了菌体密度及蛋白表达量，可实现规模化产TRIM72蛋白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种可规模化产TRIM72蛋白的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：本专利技术提供一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，所述方法步骤如下：(1)种子培养：将试管斜面活化后的BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72种子，接入摇瓶过夜培养后，接入种子罐，扩大培养至对数生长期，作为种子液；(2)配制培养基：配制高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；(3)发酵：以5％-10％的接种量将步骤(1)所得的种子液转接到步骤(2)的发酵培养基，50％-70％装液量的发酵罐中，保持溶氧在10％-50％，保持罐压为0-0.05Mpa，发酵温度为36-37℃，搅拌转速为300-1000rpm；(4)补料：当培养至溶氧开始反弹时，开始加入补料培养基，控制补料速度与溶氧联动，溶氧控制在10％以上；(5)诱导：当培养至一定阶段时，降温至20-30℃，一次性加入0.5-1mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，诱导约4h放罐。其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(1)的种子是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET22b(+)为载体，可用于高密度发酵人骨骼肌TRIM72蛋白。其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(1)是按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养2-4h，至OD600在1.0-1.2时，移种至发酵罐中。其中，所述一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(2)培养基的主要成分及其含量如下：胰蛋白胨10～20g/L、酵母粉20～30g/L、氯化钠0～1g/L、甘油2～8g/L、葡萄糖6～10g/L、KH2PO4·H2O2～5g/L、Na2HPO4·3H2O10～30g/L、2mMMgCl2·6H2O0.5～2ml/L。其中，优选胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O5g/L，Na2HPO4·3H2O15g/L，2mMMgCl2·6H2O溶液1ml/L，微量盐溶液1ml/L，pH为7.0。其中，微量盐溶液为：15ml浓盐酸加入适量的水稀释，依次加入ZnSO4·7H2O0.71g、CuSO4·5H2O0.4g、H3BO40.06g、MnSO4·H2O0.8g、CaCl20.07g、Na2MoSO4·2H2O1g、CoCl2·6H2O0.01g，定容至100ml，待彻底溶解后，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤。其中，配制高密度发酵培养基的方法如下：(1)按上述各组分的配比精确称取规定重量的组分；(2)除葡萄糖、MgCl2·6H2O、微量盐溶液外，将其他组分在发酵罐中用蒸馏水溶解，121℃条件下，灭菌20分钟；(3)葡萄糖单独灭菌，115℃条件下，灭菌20分钟；(4)待发酵罐冷却至50℃左右时，加入MgCl2·6H2O溶液，微量盐溶液，混合后降温至37℃即得。其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法步骤(3)是发酵温度37℃，搅拌转速300-1000转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；当转速达到1000r/min以上时，固定在1000r/min，随着培养过程中养分的消耗，营养物质会逐渐减少，继续培养2-4h左右。其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，步骤(4)中补料的主要组分及其含量为胰蛋白胨5～10g/L、酵母粉5～10g/L、葡萄糖200～500g/L，其中优选胰蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖300g/L。其中，所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，步骤(5)是降温至25℃，加入诱导剂0.5mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，此时溶氧与补料联动，保持溶氧在10％以上，继续诱导培养4h左右放罐。所述的高密度发酵方法，用30％氨水控制pH在7.0左右。本专利技术提供的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，所述的高密度发酵方法也可应用于BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72突变体种子，发酵TRIM72突变体蛋白。本专利技术的有益效果是：上述用于规模化产重组人骨骼肌TRIM72蛋白的高密度发酵方法，在重组大肠杆菌发酵过程中实现重组大肠杆菌的高密度生长，能显著提高大肠杆菌工程菌发酵密度，增加目的蛋白表达量，从而提高目的蛋白表达总量，提高重组人骨骼肌TRIM72或TRIM72突变体的单位产率，从而有效地减少试剂的消耗，节约成本，适合规模化工业生产的需要。附图说明图1为SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳图，其中：1、MARKER2、标准品3、TRIM72诱导前上清样品4、原发酵方法发酵TRIM72诱导后上清样品5、高密度方法发酵TRIM72诱导后上清样品6、TRIM72突变体诱导前上清样品7、原发酵方法发酵TRIM72突变体诱导后上清样品8、高密度方法发酵TRIM72突变体诱导后上清样品具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步说明。本专利技术下列实施例所用的仪器型号、试剂及其来源如下：发酵罐：BLBlO-5SJA-50SJA-VIP上海百仑生物科技有限公司蛋白纯化仪：AKTApureGE凝胶成像仪：UniversalHoodIIIBIO-RAD紫外可见分光光度计：752上海菁华科技仪器有限公司胰蛋白胨：Cat.No：LP0042OXOID酵母粉：Cat.No：LP0021OXOID实施例1高密度发酵TRIM72蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，步骤如下：(1)种子培养：将试管斜面活化后的BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72种子，接入摇瓶过夜培养后，接入种子罐，扩大培养至对数生长期，作为种子液；(2)配制培养基：配制高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；(3)发酵：以5％‑10％的接种量将步骤(1)所得的种子液转接到步骤(2)的发酵培养基，50％‑70％装液量的发酵罐中，保持溶氧在10％‑50％，保持罐压为0‑0.05Mpa，发酵温度为36‑37℃，搅拌转速为300‑1000rpm；(4)补料：当培养至溶氧开始反弹时，开始加入补料培养基，控制补料速度与溶氧联动，溶氧控制在10％以上；(5)诱导：当培养至一定阶段时，降温至20‑30℃，一次性加入0.5‑1mM IPTG(异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷)诱导，诱导约4h时放罐。

【技术特征摘要】
1.一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，步骤如下：(1)种子培养：将试管斜面活化后的BL21(DE3)/pET22b(+)/TRIM72种子，接入摇瓶过夜培养后，接入种子罐，扩大培养至对数生长期，作为种子液；(2)配制培养基：配制高密度发酵培养基，培养基降至所需温度时，接上溶氧电极，标定溶氧为100％；(3)发酵：以5％-10％的接种量将步骤(1)所得的种子液转接到步骤(2)的发酵培养基，50％-70％装液量的发酵罐中，保持溶氧在10％-50％，保持罐压为0-0.05Mpa，发酵温度为36-37℃，搅拌转速为300-1000rpm；(4)补料：当培养至溶氧开始反弹时，开始加入补料培养基，控制补料速度与溶氧联动，溶氧控制在10％以上；(5)诱导：当培养至一定阶段时，降温至20-30℃，一次性加入0.5-1mMIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导，诱导约4h时放罐。2.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)的种子是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET22b(+)为载体，可用于高密度发酵人骨骼肌TRIM72蛋白。3.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)是按照5％的接种量接种至种子罐中，培养温度37℃，搅拌起始转速300转，罐压0.035MPa，pH值7.0，溶氧与转速联动，保持溶氧在20％以上；继续培养2-4h，至OD600在1.0-1.2时，移种至发酵罐中。4.根据权利要求1所述的一种可规模化产TRIM72蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)培养基的主要成分及其含量如下：胰蛋白胨10～20g/L、酵母粉20～30g/L、氯化钠0～1g/L、甘油2～8g/L、葡萄糖6～10g/L、KH2PO4·H2O2～5g/L、Na2HPO4·3H2O10～30g/L、2mMMgCl2·6H2O0.5～2ml/L；其中，优选胰蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，氯化钠1.0g/L，甘油6g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO4·H2O5g/L，Na2HPO4·3H2O15g/L，2mMMgC...

【专利技术属性】
技术研发人员：慎东，
申请(专利权)人：慎东，
类型：发明
国别省市：陕西,61