一种酶催化正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶催化正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷进行转糖苷反应合成红景天苷的方法。本发明专利技术首先制备了一种β‑葡萄糖苷酶催化剂，然后使用该催化剂催化β‑D‑葡萄糖和正丁醇机构进行逆水解反应合成正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷，再以正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷为糖基供体在β‑葡萄糖苷酶催化剂催化下进行转糖苷反应合成红景天苷，产率达到17～35％。该方法涉及的两个反应步骤中所用的催化剂为酶，不使用其它化学催化剂，反应条件温和、选择性高，过程清洁环保，从而提供了一种酶催化合成红景天苷的可规模化生产方法。

【技术实现步骤摘要】
一种酶催化正丁基-β-D-葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法
本专利技术涉及红景天苷的合成方法，具体是一种酶催化正丁基-β-D-葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法。
技术介绍
红景天是一种珍稀药用植物,具有抗寒冷、抗疲劳、延缓机体衰老,防止老年疾病等功能。红景天苷，化学名为对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是红景天的主要有效成分。红景天苷可通过植物提取的方法获得，但由于提取得率低、野生红景天资源匮乏导致无法从红景天植物中大量获取红景天苷。红景天苷还可以通过人工合成的方法而获得。红景天苷的合成方法有化学法和酶催化法。化学合成红景天苷的主要途径有以下几种：经过酪醇的直接糖苷化反应合成；经过酚羟基保护的酪醇的糖苷化反应合成。尽管化学合成红景天苷及其类似物的技术已日趋成熟，但大多需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，而酶催化合成红景天苷的方法具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，显示了一定的应用优越性。用于酶催化合成红景天苷的常用酶为糖苷酶，如β-D-葡萄糖苷酶。该类酶为水解酶类，但能在在一定条件下催化逆水解反应，如ZhangLei等首次报道了利用黑曲霉MS-48糖苷酶Salidrosid催化p-酪醇与β-D-葡萄糖合成制备红景天苷，产率为10％。Tong等利用苹果β-D-葡萄糖苷酶催化p-酪醇与β-D-葡萄糖合成了红景天苷，产率为15.8％。然而，逆水解反应受热力学平衡的影响导致红景天苷的转化率难以提高，因此需严格控制反应体系中的水含量。此外，由于红景天苷在糖苷酶的存在下极易被水解，而糖苷酶又需要适量的水来保持其活性。因此，在β-葡萄糖苷酶催化合成糖苷的反应过程中常添加叔丁醇、1,4-二氧六环、乙腈等有机溶剂来降低酶对水的需求量、促进底物溶解和维持酶的基本活性，如专利CN201610613563.7、CN201110049173.9等所述。目前报道的β-D-葡萄糖苷酶催化红景天苷合成的诸多方法都基于逆水解反应机制。然而，β-葡萄糖苷酶还可以通过催化转糖苷反应途径来合成糖苷。相比于逆水解反应，转糖苷反应的反应速率更快、反应时间更短、产率更高。较短的反应时间意味着较高的生产强度和较低的反应成本。与以葡萄糖作为底物的逆水解反应不同，转糖苷反应的底物多为纤维二糖、pNPG、水扬苷等等。这些底物或者不溶于有机溶剂，或者价格较高。化学催化剂催化的转糖苷反应可以用正丁基糖苷作为糖基供体进行转糖苷反应合成长碳链烷基糖苷。正丁基-β-D-葡萄糖苷作为糖苷供体的优点如下：(1)正丁基-β-D-葡萄糖苷可通过酶催化逆水解方法合成，转化率可达到70％左右；(2)正丁基-β-D-葡萄糖苷在水溶液中和在有机溶剂中都有良好的溶解性；(3)使用酶作为反应的催化剂，保证了反应的绿色、环保、安全性。本专利技术拟β-葡萄糖苷酶作为催化剂，先通过逆水解法合成正丁基-β-D-葡萄糖苷，然后以正丁基-β-D-葡萄糖苷作为糖基供体进行转糖苷反应合成红景天苷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有红景天苷合成技术中存在的问题，提供一种操作简单、得率高的酶法制备红景天苷的方法。解决本专利技术的技术问题所采用的方案如下步骤：1.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备；2.酶催化合成正丁基-β-D-葡萄糖苷；3.酶催化合成红景天苷。所述的方案，步骤1中，β-葡萄糖苷酶催化剂采用如下方法制备：将β-葡萄糖苷酶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置成蛋白质质量百分比为5～20％的缓冲溶液。在缓冲溶液中加入质量百分比浓度为0.5～2.5％的环氧氯丙烷后振荡反应0.5～2小时，缓冲溶液中蛋白质与环氧氯丙烷的质量比为1:0.5～3。反应结束后将反应液在3000～5000rpm离心5～10分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。所述的方案，步骤1中，β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶、农杆菌(Agrobacterium)β-葡萄糖苷酶、白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)β-葡萄糖苷酶、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)β-葡萄糖苷酶中的任一种。所述的方案，步骤1中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液的pH值为5.5～8.0。所述的方案，步骤2中，酶催化合成正丁基-β-D-葡萄糖苷采用如下方法：将β-D-葡萄糖溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中配置成3mol/L葡萄糖溶液，加入5U的催化剂和预先恒温至50℃的正丁醇使反应混合物总体积为2mL，反应混合物中β-D-葡萄糖和正丁醇的摩尔比为1:1～3，将反应混合物在50℃的恒温振荡器中(600rpm)反应48小时。反应结束后，将反应混合物置于沸水浴中10min，减压抽滤去除沉淀，然后将滤液在80℃、0.01Mpa下蒸馏去除正丁醇和水，所得产物为正丁基-β-D-葡萄糖苷。所述的方案，步骤2中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液的pH值为5.5～8.0。所述的方案，步骤3中，酶催化合成红景天苷采用如下方法：将正丁基-β-D-葡萄糖苷溶解于叔丁醇中配置成重量百分比为6～10％的正丁基-β-D-葡萄糖苷溶液，然后加入酪醇的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和10U的β-葡萄糖苷酶催化剂，使反应混合物的总体积为2mL。将反应混合物于恒温振荡器上振荡反应8～16小时。反应结束后，在混合物加入10倍体积的甲醇摇匀，用0.45μm膜过滤获得红景天苷产品，经C18柱高效液相法检测后可知红景天苷产率达到17～35％。所述的方案，步骤3中，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为0.1～0.2M的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，缓冲液的pH值为5.5～8.0。所述的方案，步骤3中，酪醇的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中酪醇的重量百分比为15～20％。所述的方案，步骤3中，反应温度为40～60℃。所述的方案，步骤3中，C18柱高效液相法检测方法如下：在配有反相C18色谱柱(汉邦MegresC185μm)的1525型液相色谱仪(美国Waters公司)上检测产品中红景天苷含量。样品的分析柱温为36℃，流动相为甲醇水溶液(甲醇:水＝3:7)，流动相流速为0.8mL/min。检测器为2996型紫外检测器，波长230nm，进样量为20μL。本专利技术与现有技术相比，主要具有以下优点：正丁基-β-D-葡萄糖苷由酶催化方法合成，条件温和、无污染，产率达75％。然后以正丁基-β-D-葡萄糖苷为糖基供体合成红景天苷，比先前报道中使用的糖基供体便宜，红景天苷产率达到17～35％。具体实施方式：实施实例11.β-葡萄糖苷酶催化剂的制备将杏仁β-葡萄糖苷酶(北京宝希迪科技有限公司生产)用0.1M、pH5.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(南昌雨露实验器材有限公司生产)配置成蛋白质质量百分比为5％的酶缓冲溶液。在β-葡萄糖苷酶的缓冲溶液中加入质量百分比浓度为0.5％的环氧氯丙烷(上海紫一试剂厂生产)后振荡反应0.5小时。缓冲液中蛋白质与环氧氯丙烷的质量比为1:0.5。反应结束后将反应液在3000rpm下离心5分钟，收集沉淀冷冻干燥，即为β-葡萄糖苷酶催化剂。2.酶催化合成正丁基-β-D-葡萄糖苷将β-D-葡萄糖(石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司生产)溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶催化正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法，其特征在于采用β‑葡萄糖苷酶催化剂催化β‑D‑葡萄糖和正丁醇进行反应，在反应48小时后收集反应液，将反应混合物置于沸水浴中10min，减压抽滤去除沉淀。然后将滤液在80℃、0.01Mpa下蒸馏去除正丁醇和水后得到正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷。将正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷溶解于叔丁醇中配置成重量百分比为6～10％的正丁基‑β‑D‑葡萄糖苷溶液，然后加入含酪醇的磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液和β‑葡萄糖苷酶催化剂，于恒温振荡器上振荡反应8～16小时。反应结束后，在反应混合物加入10倍体积的甲醇摇匀，用0.45μm膜过滤获得红景天苷，经C18柱高效液相法检测后可知红景天苷产率达到17～35％。

【技术特征摘要】
1.一种酶催化正丁基-β-D-葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法，其特征在于采用β-葡萄糖苷酶催化剂催化β-D-葡萄糖和正丁醇进行反应，在反应48小时后收集反应液，将反应混合物置于沸水浴中10min，减压抽滤去除沉淀。然后将滤液在80℃、0.01Mpa下蒸馏去除正丁醇和水后得到正丁基-β-D-葡萄糖苷。将正丁基-β-D-葡萄糖苷溶解于叔丁醇中配置成重量百分比为6～10％的正丁基-β-D-葡萄糖苷溶液，然后加入含酪醇的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和β-葡萄糖苷酶催化剂，于恒温振荡器上振荡反应8～16小时。反应结束后，在反应混合物加入10倍体积的甲醇摇匀，用0.45μm膜过滤获得红景天苷，经C18柱高效液相法检测后可知红景天苷产率达到17～35％。2.根据专利要求1所述的一种酶催化正丁基-β-D-葡萄糖苷转糖苷制备红景天苷的方法，其特征在于β-葡萄糖苷酶为杏仁β-葡萄糖苷酶、农杆菌(Agrobacterium)β-葡萄糖苷酶、白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)β-葡萄糖苷酶、海栖热袍菌(Thermotogamari...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32