一种固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法。本发明专利技术利用固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法具体如下：首先制备重组枯草芽孢杆菌，构建L‑阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂；将重组枯草芽孢杆菌芽孢加入到D‑半乳糖反应液中，一定条件下振荡转化，得到D‑塔格糖。本发明专利技术构建一种新型的食品安全的固定化酶催化剂，并优化固定化酶合成D‑塔格糖的生物转化工艺，提高其转化率；其中，固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10

【技术实现步骤摘要】
一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，特别涉及一种L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化D-半乳糖合成D-塔格糖的方法。
技术介绍
D-塔格糖是自然界存在的一种稀有己酮糖，它与蔗糖有相同的口感，甜度为蔗糖的92％，美国食品药品监督管理局(FDA)已经确认了其食品安全性(GRAS)。D-塔格糖作为低热量甜味益生元，代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等功效；此外，D-塔格糖对于治疗贫血症等疾病有潜在的效果，也可用于抗氧化剂和细胞保护方面，在医药行业也具有广泛的应用。D-塔格糖在欧洲市场的份额逐年增加，据预测D-塔格糖将会以每年20％-50％的稳定速度增长。而国内D-塔格糖的生产消费市场还是空白。由于中国人口基数大，糖尿病患者高居世界首位，功能性甜味剂市场广阔，D-塔格糖在中国市场上的发展潜力极大。目前，D-塔格糖的生产有化学法和生物酶法两种，两种方法的底物均为D-半乳糖，而D-半乳糖可以通过水解乳清(脱蛋白乳清)或乳糖获得，而乳清或脱蛋白乳清作为乳制品工业的副产物，资源丰富且价格低廉。化学法生产D-塔格糖存在产物纯化复杂、废物处理成本高等问题，因而近来利用L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)，通过生物酶法制备D-塔格糖并实现工业化生产成为研究的热点。另外，枯草芽孢杆菌作为一种食品安全菌株，在表达外源蛋白方面具有突出优势。依靠枯草芽孢杆菌在营养缺乏或环境胁迫下产生的芽孢的独特抗逆性，通过芽孢表面展示技术将具有催化活性的外源蛋白酶展示在芽孢表面，可以大大增加酶制剂的应用条件和范围。利用L-阿拉伯糖异构酶可以比较方便的将D-半乳糖转化D-塔格糖，所用的酶一般均为重组的基因工程酶。文献报道了利用固定化L-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生成D-塔格糖的研究。如2014年有研究学者利用CotX作为锚定蛋白，通过枯草芽孢杆菌芽孢表面展示固定化来自Lactobacillusfermentum的L-阿拉伯糖异构酶，固定化活力为2.02×10-10U/芽孢，以100g/LD-半乳糖为底物时，转化率最高可达75％，固定化酶重复利用5次后，残余酶活力为19％；再如2012年有研究人员利用海藻酸钠方法固定化Lactobacillusfermentum细胞，以100g/LD-半乳糖为底物时，转化率最高可达60％，固定化细胞重复利用8次后，残余酶活力为90％。同时，有专利也报道了固定化法生产D-塔格糖的情况，如，2008年相关专利报道了一株重组L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌E.coliBL21/pET-araA，通过培养工程菌并抽提粗酶液后，用5％(w/w)的海藻酸钠固定化粗酶利用半乳糖的转化生产D-塔格糖，转化率可达60.2％，重复反应10次批，转化率在50-60％之间；再如，另一专利公开了利用游离的或者经固定化的Lactobacillusfermentum细胞的方式转化D-半乳糖制备D-塔格糖，D-塔格糖对底物的转化率可达50％。但是，以上研究D-塔格糖的转化率均比较低，固定化酶重复利用后，残余酶活力较低，稳定性较差，进而影响到D-半乳糖到D-塔格糖的产量，也不太适合于塔格糖的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有固定化酶生物合成D-塔格糖技术中存在的缺陷，如从底物D-半乳糖到D-塔格糖转化率低，L-阿拉伯糖异构酶活力低、稳定性差等，本专利技术提供了一种L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，优化固定化酶合成D-塔格糖的生物转化工艺，实现食品级D-塔格糖的稳定高效生产。本专利技术提供了一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，具体按照以下步骤进行：(1)将重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis-pHS)在DSM培养基中37℃，160rpm条件下培养36h，8000rpm离心并将将沉淀物重悬于pH6.5的磷酸缓冲液中，加入0.5％的溶菌酶，37℃处理1h；8000rpm离心收集沉淀物，用1MNaCl和1MKCl洗涤后，8000rpm离心收集，得重组枯草芽孢杆菌芽孢；将重组枯草芽孢杆菌芽孢重悬在pH6.5的磷酸缓冲液中，配成浓度为0.78×109芽孢/mL的重组枯草芽孢杆菌芽孢溶液备用；所述重组枯草芽孢杆菌芽孢表面含有L-阿拉伯糖异构酶固定化酶；重组枯草芽孢杆菌芽孢即为构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂。(2)将重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入到反应液中，得到混合液；其中，重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液与反应液的体积比为5-15:100；反应液组成为：D-半乳糖20-150g/L，MnCl21mM，100mMpH6.5磷酸钾缓冲液；(3)将步骤(2)的混合液置于65-75℃，220rpm条件下振荡转化16-24h，得到含有D-塔格糖的转化液。(4)8000rpm离心并收集(3)中重组芽孢加入400mL反应液中；(5)依次重复(3)和(4)4次，计算转化率和L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂的残留活力。其中步骤(5)所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mMD-半乳糖，1mMMnCl2，适量重组芽孢，100mMpH6.5磷酸钾缓冲液，68℃反应30min，冰浴终止反应，通过测定D-塔格糖的生成量计算酶活力和残留活力。本专利技术制备的重组枯草芽孢杆菌芽孢，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10-9U/芽孢；D-塔格糖的转化率达95％。与现有技术相比较，本专利技术的有益效果体现如下：(1)本专利技术将购自于中国工业微生物菌种保藏中心菌株编号为CCICC6239的益生菌-短乳杆菌的L-AI，并通过益生菌-枯草芽孢杆菌168的CotB锚定蛋白，并利用设计的Linker序列，通过来源于益生菌的没有抗生素基因的穿梭质粒pHS构建重组质粒，展示于食品安全的枯草芽孢杆菌的芽孢表面；构建一种新型的食品安全的固定化酶催化剂，提高该固定化酶的活力与稳定性；并优化固定化酶合成D-塔格糖的生物转化工艺，提高其转化率，从而开发一套绿色、安全、高效、经济的D-塔格糖的全新合成技术与方法，实现食品级D-塔格糖的高效生产。(2)另外，通过以上方法制备的固定化L-AI具有以D-半乳糖为底物生物合成D-塔格糖的高转化率。以20-150g/L的D-半乳糖为底物70℃转化生产D-塔格糖，其转化率可达95.0％(图1)。重复利用5次后，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶催化剂残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶催化剂残留活力仍在85％以上。制备的固定化L-AI具有较高的活力和较高稳定性特点，固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10-9U/芽孢。通过本专利技术方法制备D-塔格糖具有操作简单、成本低廉，绿色安全、高效率等特点，具有一定的实际意义。附图说明图1为本专利技术中L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化不同浓度D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率，其中横坐标为D-半乳糖的不同浓度，纵坐标为D-塔格糖的转化率。具体实施方式本专利技术的短乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CCICC6239。本专利技术所述L-AI的编码基因araA序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法，其特征在于，所述固定化酶为重组枯草芽孢杆菌芽孢表面存在的L‑阿拉伯糖异构酶，所述重组枯草芽孢杆菌芽孢即为构建的固定化酶催化剂，包括以下步骤：（1）制备重组枯草芽孢杆菌芽孢，并将其配成重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液；（2）将一定量的重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入反应液中，得到混合液；（3）将步骤（2）的混合液置于一定温度下振荡转化一段时间，得到含有D‑塔格糖的转化液。

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，其特征在于，所述固定化酶为重组枯草芽孢杆菌芽孢表面存在的L-阿拉伯糖异构酶，所述重组枯草芽孢杆菌芽孢即为构建的固定化酶催化剂，包括以下步骤：（1）制备重组枯草芽孢杆菌芽孢，并将其配成重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液；（2）将一定量的重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入反应液中，得到混合液；（3）将步骤（2）的混合液置于一定温度下振荡转化一段时间，得到含有D-塔格糖的转化液。2.根据权利要求1所述的固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤（1）中，重组枯草芽孢杆菌芽孢的制备方法为：将重组枯草芽孢杆菌在DSM培养基中37℃，160rpm条件下培养36h；8000rpm离心，将沉淀物重悬于pH6.5的磷酸缓冲液中，加入0.5%的溶菌酶，37℃处理1h；8000rpm离心收集沉淀物，并用1MNaCl和1MKCl洗涤后，8000rpm离心收集，得重组枯草芽孢杆菌芽孢。3.根据权利要求1所述的固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤（1）中，重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液的浓度为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，张欢欢，员君华，杨苗苗，朱婧斐，田纳，张国艳，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32