体细胞克隆犬的方法技术

本发明专利技术涉及体细胞克隆犬的方法，尤其是涉及采用低渗透压融合液连同自体胚胎移植技术制备体细胞克隆犬的方法。

【技术实现步骤摘要】
体细胞克隆犬的方法
本专利技术涉及改进的体细胞克隆犬的方法，尤其是涉及采用低渗透压融合液连同自体胚胎移植技术制备体细胞克隆犬的方法。
技术介绍
动物克隆技术是将细胞通过核移植，转移至受体卵母细胞内，生产与供体细胞具有相同DNA序列信息的动物个体。该技术的最大特点是，所出生的克隆动物具有与供体细胞完全一致的遗传信息。因此采用克隆技术可以复制动物体细胞，克隆技术可应用于转基因动物生产、优良家畜扩繁、濒危动物资源保存、进行治疗性克隆等。犬是人类重要的家养动物，不仅可以作为宠物进行饲养，同时也是医学及生物学研究中重要的大型模式动物。利用克隆技术生产克隆犬，不仅可以克隆宠物犬，为人类生活带来乐趣，同时利用该技术生产转基因及基因敲除动物模型，将极大推动医学及生物学的发展。首例体细胞克隆犬于2005年获得成功，由韩国科学家黄禹锡教授的科研团队完成，利用体内成熟的犬卵母细胞进行核移植，成功克隆了阿富汗猎犬“Snuppy”。犬体细胞克隆技术不仅可以应用于科研，在工作犬克隆方面也得到的广泛的应用。2007年底，韩国7头体细胞克隆警犬诞生，这7头拉布拉多猎犬是世界首批体细胞克隆的警犬，是利用一头名为“Chase”的拉布拉多猎犬的体细胞克隆成功的。这些克隆警犬在出生后不久即开始接受专业训练，并在训练中表现出很多缉毒犬所必备的优良特性。2009年，韩国科学家家利用体细胞克隆技术，成功克隆了5只美国“911事件”英雄警犬“特拉克”，这5只克隆犬继承了“特拉克”优良的基因，具有和“特拉克”一样优秀的工作能力。然而，在现有体细胞克隆犬的技术中，常常选择同期发情的母犬进行异体胚胎移植，成功率较低，造成克隆犬生产成本的增加，而且，异体胚胎移植所需要的发情母犬数量较多，操作手段复杂，难以实现产业化的应用。因此，非常需要改进现有的体细胞克隆犬技术，以简单的操作手段、较少的实验用犬和低成本获得高成功率的体细胞克隆犬，从而实现体细胞克隆犬的产业化应用。
技术实现思路
本专利技术采用了低渗透压的融合液，提高了胚胎的融合效率；而且胚胎移植受体犬只冲取单侧输卵管中的卵母细胞，卵母细胞经过核移植、融合及激活后，与其他供体犬获得的克隆胚胎，共同移植入未冲卵的另一侧输卵管中，实现自体/异体相结合的胚胎移植，提高了克隆犬的怀孕效率。第一方面，本专利技术提供了体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中。在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，需要先鉴定进入发情期的母犬，具体而言，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵胞素及黄体生成素，当角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右时，认定母犬处于排卵期。在排卵后72h-120h，进行单侧冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理。优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。所述融合液的组成如下：0.2-0.28M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，所述融合液的组成如下：0.24M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，电融合采用2-4kv/cm的电压。也可以采用胞质内注射的方法将犬体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，胞质内注射一般用Piezo微注射系统，直接把整个供体细胞或供体细胞核注入胞质内，胞质内注射的方法不需要进行电融合。第二方面，本专利技术提供了体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬和供体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：一部分去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自双侧输卵管均进行了冲卵的供体母犬的双侧输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的输卵管中。在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，需要先鉴定进入发情期的母犬，具体而言，每天抽血检测阴道涂片、孕酮、促卵胞素及黄体生成素，当角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右时，认定母犬处于排卵期。在排卵后72h-120h，进行冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理。优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。优选地，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。所述融合液的组成如下：0.2-0.28M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，所述融合液的组成如下：0.24M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。优选地，电融合采用2-4kv/cm的电压。也可以采用胞质内注射的方法将犬体细胞导入去核卵母细胞的胞质中，胞质内注射一般用Piezo微注射系统，直接把整个供体细胞或供体细胞核注入胞质内，胞质内注射的方法不需要进行电融合。本专利技术的体细胞可以是来自各种组织和器官，例如胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管、管腔内皮等的细胞。可用于本专利技术方法的体细胞的例子包括但并不限于：胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。从上述实施方案可以看出，本专利技术的方法中受体母犬本身也提供卵母细胞，而且是只对单侧输卵管进行冲卵来获得卵母细胞；并且将经核移植、电融合和激活获得的克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵的那侧输卵管中，因此，上述两种技术方案必然涉及自体移植，与现有技术中异体移植需要发情母犬数量较多相比大大减少了实验用犬的使用量。现有技术中，通常需要40只以上的犬。本专利技术的方法只需要几只实验用犬。而且，现有技术中需要选择同期发情的母犬进行异体胚胎移植，但是母犬发情鉴定较难，通过发情进行同期化鉴定准确率较低，这也是造成异体胚胎移植成功率较低的原因。相比而言，本专利技术的技术方案中必然包含的自体移植很大程度上避免了通过发情进行同期化判断的步骤；同时，自体移植可以大幅度提高克隆胚胎的着床效率，从而实现了降低克隆犬的生产成本和高效生产克隆犬的目标。此外，本专利技术采用渗透压为200-280mOSM的融合液，与现有技术中渗透压为280-310mOSM的融合液相比，显著提高了胚胎的融合效率。缩略语和关键术语定义：克隆：采用相应的技术手段，生产与供核细胞具有相同DNA序列的动物个体。NT：体细胞核移植本文档来自技高网...

【技术保护点】
体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵那侧的输卵管中。

【技术特征摘要】
1.体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)从受体母犬制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母犬；其特征在于：去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母犬冲卵的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母犬未冲卵那侧的输卵管中。2.根据权利要求1的方法，在步骤(2)从受体母犬制备去核卵母细胞中，鉴定角化细胞比例达到80-90％以上，孕酮水平达到4-7ng/mL左右的母犬作为处于排卵期的母犬以用作受体母犬。3.根据权利要求2的方法，在排卵后72h-120h，进行单侧冲卵获得成熟的卵母细胞，然后进行成熟卵母细胞的去核处理。4.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为200mOSM-280mOSM的融合液。5.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，在上述步骤(3)中采用电融合将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中，并且电融合中使用渗透压为240mOSM的融合液。6.根据权利要求4的方法，所述融合液的组成如下：0.2M-0.28M甘露醇，0.1mMMgSO4，0.5mMHepes和0.05％BSA。7.根据权利要求4-6任一项的方法，其特征在于电融合采用2kv/cm-4kv/cm的电压。8.根据权利要求1-7任一项的方法，所述体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。9.根据权利要求1-7任一项的方法，所述体细胞选自：胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。10.体细胞克隆犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，米继东，赵建平，
申请(专利权)人：北京希诺谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11