AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其包括：构建含有外源基因的第一重组质粒，并将其包装得到第一rAAV；构建含有AAV Rep78的第二重组质粒，并将其包装得到第二rAAV；第一rAAV和第二rAAV共同转导人成体细胞，将外源基因定点整合于人成体细胞19号染色体的AAVS1位点。采用本发明专利技术技术手段得到的基因工程化人成体细胞株能够稳定表达外源基因，将得到的基因工程化人成体细胞株在体外诱导成多能干细胞，能保持干细胞的多能性及分化潜能，并且稳定表达外源基因。本发明专利技术可用于赋予细胞新的功能，或用于纠正/补偿由于基因异常/缺陷所引起的疾病，或为干细胞基因治疗提供一种可行的方法。

【技术实现步骤摘要】
AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法
本专利技术涉及人iPS细胞的一种构建方法。更具体地说，本专利技术涉及一种AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法。
技术介绍
诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS细胞)是一类由分化的体细胞(如成纤维细胞，血细胞)经过重编程而生成的细胞。iPS细胞与胚胎干细胞一样，几乎能够分化形成所有类型的细胞；而iPS细胞的来源与胚胎干细胞不同，iPS细胞来自于分化的体细胞，而非胚胎，可避免使用胚胎干细胞的伦理学上的争议。iPS细胞与成体干细胞也不同，成体干细胞是在人体中自然产生，数量较少，限制了其在生物医学中的应用。2006年，日本科学家山中伸弥(ShinyaYamanaka)专利技术了将小鼠的成纤维细胞诱导生成多能干细胞的方法，他利用逆转录病毒载体将四个转录因子Oct-3/4、SOX2、c-Myc和Klf4转入分化的体细胞中，使其重新编程得到了iPS细胞[参见TakahashiK,YamanakaS,2006.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126:663-676]。2007年，他将该方法应用到了人类皮肤成纤维细胞[参见TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,NaritaM,IchisakaT,TomodaK,YamanakaS,2007.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131:861-872]，山中伸弥教授也因此获得了2012年诺贝尔医学生理学奖。JamesThomson的研究组也同时报道了用慢病毒载体引入Oct4、Sox2加Nanog和LIN28这四个因子诱导产生人类iPS细胞[参见YuJ,VodyanikMA,Smuga-OttoK,Antosiewicz-BourgetJ,FraneJL,TianS,NieJ,JonsdottirGA,RuottiV,StewartR,etal.2007.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318:1917-1920]。2009年JamesThomson的研究组使用非整合型附着体载体将成纤维细胞诱导生成iPS细胞，去除非整合型附着体后得到的iPS细胞中不含有外源基因，这是iPS细胞将被应用于生物医学的一大进步[参见YuJ,HuK,Smuga-OttoK,TianS,StewartR,SlukvinII,ThomsonJA,2009.HumanInducedPluripotentStemCellsFreeofVectorandTransgeneSequences.Science324:797-801]。2013年北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队使用小分子化合物诱导体细胞重编程为iPS细胞，开辟了一条全新的实现体细胞重编程形成iPS细胞的途径[参见HouPP,LiYQ,ZhangX,LiuC,GuanJY,LiHG,ZhaoT,YeJQ,ZhaoY,DengHK,2013.Pluripotentstemcellsinducedfrommousesomaticcellsbysmall-moleculecompounds.Science341:651-654]。iPS细胞技术可以将患有某种特定疾病的病人的成体细胞重编程为人类干细胞，从而使iPS细胞中包含一套完整的遗传信息由此构建的该疾病模型可以用来测试新药物和疗法[参见YamanakaS,2012.Inducedpluripotentstemcells:past,present,andfuture.Cell-StemCell,10:678-684]。还可以用iPS细胞模拟人类正常细胞的发育过程，以及研究诱导iPS细胞生成人类各种体细胞所需条件[参见NishikawaS,GoldsteinRA,NierrasCR,2008.Thepromiseofhumaninducedpluripotentstemcellsforresearchandtherapy.Nat.Rev.Mol.CellBiol.9:725-729]。腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)是当前最受欢迎的人类基因治疗载体之一，目前没有报道AAV引起任何疾病。野生型的AAV能潜伏生长在人类细胞19号染色体q臂上的AAVS1位点[参见SamulskiRJ,ZhuX,XiaoX,BrookJD,HousmanDE,EpsteinN,HunterLA,1991.Targetedintegrationofadeno-associatedvirus(AAV)intohumanchromosome19.EMBOJ.10:3941-3950]。定点整合需要的分子基础是：①来自于AAV的整合酶Rep68/78；②Rep结合位点(Rep-bindingsite,RBS)和整合酶切口位点(Terminalresolutionsequence,TRS)；③人类细胞中的AAVS1位点[参见LindenRM,WardP,GIRAUDC,WinocourE,BernsKI,1996.Site-specificintegrationbyadeno-associatedvirus.ProcNatlAcadSciUSA.93:11288-11294；BalagúeC,KallaM,ZhangWW,1997.Adeno-associatedvirusRep78proteinandterminalrepeatsenhanceintegrationofDNAsequencesintothecellulargenome.JVirol.71:3299-3306；GiraudC,WinocourE,BernsKI,1994.Site-specificintegrationbyadeno-associatedvirusisdirectedbyacellularDNAsequence.ProcNatlAcadSciUSA.91:10039-10043；MenesesP,BernsKI,WinocourE,2000.DNASequenceMotifsWhichDirectAdeno-AssociatedVirusSite-SpecificIntegrationinaModelSystem.JVirol.74:6213-6216]，AAVS1位点的基本特征是含有Rep结合位点和整合酶切口位点[参见OgataT,KozukaT,KandaA,2003.IdentificationofanInsulatorinAAVS1,aPreferredRegionforIntegrationofAdeno-AssociatedVirusDNA.JVirol.77:9000-9007]本文档来自技高网...

【技术保护点】
AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其特征在于，包括：构建含有外源基因的第一重组质粒，并将其包装得到第一rAAV；构建含有AAV Rep78的第二重组质粒，并将其包装得到第二rAAV；所述第一rAAV和第二rAAV共同转导人成体细胞，将所述外源基因定点整合于人成体细胞19号染色体的AAVS1位点。

【技术特征摘要】
1.AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其特征在于，包括：构建含有外源基因的第一重组质粒，并将其包装得到第一rAAV；构建含有AAVRep78的第二重组质粒，并将其包装得到第二rAAV；所述第一rAAV和第二rAAV共同转导人成体细胞，将所述外源基因定点整合于人成体细胞19号染色体的AAVS1位点。2.如权利要求1所述的AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其特征在于，应用流式细胞技术检测并筛选得到定点整合外源基因的人成体细胞。3.如权利要求2所述的AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的构建方法，其特征在于，将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc引入到定点整合有外源基因的人成体细胞中，得到ips细胞。4.如权利要求1所述的AAVS1位点定点整合外源基因的人iPS细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓玫，张春，姜岩，袁运，魏静，王东鑫，王飞飞，魏峥，曹金晶，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32