基因的应用及动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及基因的应用及动物模型的构建方法。本发明专利技术公开了Oxtr基因可以作为治疗乳腺癌的靶基因，催产素受体OXTR过表达提供转基因小鼠乳腺癌诱导模型，可以用于乳腺癌致病机理研究，也可以用于药物筛选和药效测试。

【技术实现步骤摘要】
基因的应用及动物模型的构建方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及基因的应用及动物模型的构建方法。
技术介绍
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，威胁着全球女性的生命健康。每年全世界有超过167万女性患乳腺癌，而其中有52.9％发生在发展中国家。实验动物模型可以复制某些人类疾病，为医学研究的重要手段之一。乳腺癌实验动物模型在乳腺癌发病机理研究、药物有效性评估等方面起着非常关键的作用，具有广阔的前景。乳腺癌动物模型最常使用的动物包括鼠类动物、犬、猫等，均能产生自发性乳腺癌，其中移植型模型最常使用的动物则是裸鼠(NudeMice)。Grist在1962年从非近交系小鼠中发现。由于裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，肿瘤移植后生长良好，并能保持肿瘤细胞的原有形态及病理特性，是肿瘤研究中较为理想和常用的动物实验工具之一。乳腺癌裸鼠动物模型的建立的方法较多，从最初的自发性、诱发性模型发展到移植型、转基因型、基因敲除模型等。G蛋白偶联受体参与重要的生物学功能，目前新上市的药物有40％是针对G蛋白偶联受体的，可以说G蛋白偶联受体是新药物研发的摇篮。人类的催产素受体OXTR属于G蛋白偶联受体家族的成员，由389个氨基酸组成，其蛋白为含有7个跨膜结构域的多肽。基因定位于染色体的3p25.3，跨度约为19kbp，含有3个内含子和4个外显子和7个跨膜结构域。第二个跨膜结构域与受体本身的活化有关，第三和第六个跨膜结构域是G蛋白的结合位点。当催产素刺激时，催产素受体与G-蛋白相偶联，激活磷脂酶C，通过细胞内的磷酸肌醇信号系统，诱导细胞质内Ca2+浓度升高，导致子宫在分娩时的强烈收缩。催产素受体广泛分布于杏仁核、海马、纹状体、前扣带皮层、脑干、伏隔核、膝下皮层等脑区，其上有很多不同的结合位点，对催产素有很强的亲和力。除了脑神经组织高表达外，在小鼠体内，OXTR主要表达在子宫基层、乳腺导管肌上皮细胞中、肾小管中，在脑的前嗅觉区域、海马的CA2和CA3区域、屏状核、皮质杏仁核、下丘脑弓状核以及整个脑的皮质区域都有表达。但是，催产素受体在乳腺表达的研究未见报道。因此，提供催产素受体在乳腺表达中的应用以及构建小鼠乳腺癌模型对治疗乳腺癌具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种基因的应用及动物模型的构建方法。本专利技术公开了Oxtr基因可以作为治疗乳腺癌的靶基因，催产素受体OXTR过表达提供转基因小鼠乳腺癌诱导模型，可以用于乳腺癌致病机理研究，也可以用于药物筛选和药效测试。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了oxtr基因作为预防和/或治疗乳腺癌的药物靶点的应用。本专利技术还提供了oxtr基因的过表达在构建乳腺癌动物模型中的应用。本专利技术还提供了oxtr基因的过表达在药物筛选或药效测试中的应用。本专利技术还提供了oxtr基因的表达抑制剂在制备预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。本专利技术还提供了一种表达载体，含有编码oxtr基因的核苷酸序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，提供的表达载体还含有β-Actin启动子和/或β-Globin内含子。转基因从广义上理解是对生物基因组的人为修饰，包括随机的基因片段插入，基因敲除，基因定位敲入，基因定点突变等。现如今转基因技术的应用非常广泛，比如：蛋白的生产(酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药，活性蛋白，特异修饰蛋白，如凝血因子)；实验中病理模型的构建，利用动物模型研究疾病的发生机理及药物药效测试；应用在器官移植上，解决器官不足，重复感染问题；以及对品种的改良(抗病，产量，营养价值提升)和疾病的治疗(治疗遗传缺陷，组织再生)。常见的转基因技术有：受精卵细胞核(DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性)，利用精子转染DNA(效率低，重复性不好)，利用转坐子进行DNA在基因组的插入(技术难度高，随机性差)，病毒感染(效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患)，干细胞/胚胎显微注射(常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，大动物还不成功)，核移植/动物克隆(大动物基因定位修饰唯一途径，技术难度大，效率低)。对于转基因载体的构建主要分为以下几步：启动子选取，cDNA选取，PolyA选用，内含子和封闭区以及典型转基因载体结构的使用。β-Actin启动基因在乳腺、卵巢和子宫这样的生殖器官高表达，而本专利技术涉及的催产素受体基因OXTR恰恰主要高表达这些生殖器官中，尤其是乳腺。因此本专利技术通过PCR扩增带有这个启动子和内含子,选择带有PolyA封闭区的载体，构建载体。从小鼠体内通过PCR得到了准确的OXTR的编码序列，然后纯化DNA片段(去除原核载体序列)后进行核显微注射，浓度为2.5-4ng/μL。受精卵细胞核显微注射的主要操作过程如下：1)促排卵激素超排、合笼；2)分离E0.5受精卵；3)DNA显微注射；4)胚胎培养过夜；5)胚胎回移代孕鼠；6)切尾鉴定；7)传代杂交；8)表达分析。转基因技术常见的问题为：有限的启动子信息，不完全的启动子，造成基因不表达或表达差异；DNA插入的随机性，多拷贝性，不表达，低表达，错表达等鼠系间差异，为了避免这一问题，我们可以插入减少转基因受插入位点影响的封闭区(insμlaters)序列；基因高表达可能造成的毒性，得不到表达转基因鼠系；转基因片段的大小有限制，2kb到mb，大部分2-10kb，容易注射，P1质粒(PAC)，70kb左右，黏度大，细菌人工染色体BAC，120kb左右，黏度更大，酵母人工染色体YAC，500kb-1mb大小，非常难。表达水平与拷贝数无紧密关联，多数拷贝被甲基化或转录因子浓度限制；影响转基因成功与否的其它因素：DNA的浓度(2-3ng/μL)，纯度，如嗅化乙锭、酒精和EDTA含量等。本专利技术还提供了所述的表达载体在构建乳腺癌动物模型中的应用。本专利技术还提供了一种乳腺癌动物模型的构建方法，其特征在于，构建所述的表达载体，转入动物体内，获得乳腺癌动物模型。本专利技术还提供了所述的构建方法获得的乳腺癌动物模型在药物筛选或药效测试中的应用。本专利技术还提供了一种药物筛选或药效测试的方法，如所述的构建方法获得的乳腺癌动物模型服用待测药物，根据对乳腺癌的测试效果获得该药物是否适用于治疗乳腺癌或其预防和/或治疗乳腺癌的效果。本专利技术利用转基因技术进行了乳腺癌疾病模型的建立，首次利用β-actin启动子进行超表达催产素受体OXTR，得到的转基因小鼠模型(++OxtR)从两个半月起就不同程度出现乳头溢乳的现象(未怀孕产乳)，在6个月龄时开始发生乳腺癌，14个月龄时高达90％以上发生乳腺癌。我们首次发现催产素受体OXTR主要在乳腺超表达，过表达OXTR可以诱导乳腺癌发生。本专利技术成功构建了催产素受体基因OXTR高表达小鼠，提高RNA适时定量分析，WesternBlot分析，证明催产素受体基因OXTR在乳腺等组织高表达，不受乳腺发育过程的调节。催产素受体OXTR过表达乳腺癌小鼠模型是比较理想的实验动物模型，是完全内源性的，小鼠容易大量繁殖，大规模进行药物筛选和药物药效测试。移植乳腺癌细胞到裸鼠，构建乳腺癌病理模型是目前最常用的模型，裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，本身就是免疫缺陷型小鼠，不能体现体内免疫系统的作用，再加上用药很容易出现生病或无法存活的现象。催产素受体OX本文档来自技高网...

【技术保护点】
oxtr基因作为预防和/或治疗乳腺癌的药物靶点的应用。

【技术特征摘要】
1.oxtr基因作为预防和/或治疗乳腺癌的药物靶点的应用。2.oxtr基因的过表达在构建乳腺癌动物模型中的应用。3.oxtr基因的过表达在药物筛选或药效测试中的应用。4.oxtr基因的表达抑制剂在制备预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。5.一种表达载体，其特征在于，含有编码oxtr基因的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，还含有β-Actin启动子和/或β-Globin内含子。7.根据权利要求5或6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑耀武，李丹，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22