一种昆虫细胞的光控表达载体及应用制造技术

技术编号:17770324 阅读:40 留言:0更新日期:2018-04-21 23:03
本发明专利技术公开了一种昆虫细胞的光控表达载体及应用,申请人基于VP‑EL222光控转录激活系统,在昆虫细胞表达载体pMIB/V5‑HisA上成功构建阳性质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP‑EL222和对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP;转染Sf9细胞后,绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激后,红色荧光蛋白表达;对照质粒pMIB‑C120‑mCherry‑GFP转染Sf9细胞后,绿色荧光蛋白表达而红色荧光蛋白不表达。经蓝光照射刺激,由于没有EL222转录因子,红色荧光蛋白仍然不表达。所述光控诱导表达系统首次成功运用到昆虫细胞上,拓展了该技术的应用范围。本发明专利技术所构建的验证方法质粒也为利用光控诱导表达技术提供了灵活和易用的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种昆虫细胞的光控表达载体及应用
本专利技术属于生物工程领域,具体涉及一种昆虫细胞的光控表达载体及应用。
技术介绍
随着转基因技术的发展,可控的基因表达调控系统成为生物医学研究及生物技术中不可或缺的工具。过去的几十年,化学调控的基因表达系统被广泛用于从时间上调控基因的表达。但是,由于这些小分子诱导物可以自由地扩散,难以消除以及对细胞功能潜在的脱靶效应,所以很难在空间和时间上精确地控制基因的表达。然而,光是一种理想的基因表达诱导物,可控强,没有毒性,并且可以实现对目的基因表达的时间、空间双重精确控制。因此,光控基因表达系统成为了精确控制基因表达的前途光明的工具。尽管如此,当前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用,比如:蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用。在我们这里将展示一个新的光控表达系统,它没有前述的缺点,且已在哺乳动物细胞及模式动物斑马鱼中被证明广泛的适用性。该系统不仅将可为对细胞生物学、发育生物学、神经生物学等生命科学基础研究提供创新性的工具,还可广泛用于生物工程、人类疾病的诊疗等应用领域。该光控系统是以C120DNA结合序列与EL222转录因子为基础的光调控基因表达系统(Motta-Menaetal.,2014;Rivera-Cancel,Getal.,2012)。EL222转录因子,最初源于一个细菌的光-氧-压蛋白,被蓝光照射时就会二聚化结合到C120DNA上。这个系统的光依赖转录激活作用只需少量元件,一个光敏结构域LOV,一个螺旋-转角-螺旋(H-T-H)DNA结合结构域。黑暗时LOV结构域结合着HTH结构域,覆盖了对于成为二聚体而结合到DNA所必需的HTH4α位点。蓝光照射会触发光化学反应:LOV结构域中的黄素蛋白复合物打断了LOV和HTH的相互作用,使EL222二聚化,从而发挥DNA结合蛋白活性。这些反应在黑暗中又会反过来进行,其逆反应在停止蓝光照射后将很快发生,这是快速去激活作用的基础。这个系统对控制表达的目标蛋白很大的可调表达范围,敏捷的激活和去激活作用,以及与光强度有足够高的线性相关性。总之,各项研究表明C120-EL222系统宽广的通用性以及它作为光遗传学工具的优势。目前,以C120-EL222为基础的光控系统在哺乳动物细胞中得到了广泛的应用,在时间和空间的操控方面表现出光控系统明显的优势(Nashetal.,2011;Motta-Menaetal.,2014)。进一步,科学家尝试在斑马鱼中验证了该光控系统的可行性,虽然可以实现光控表达,但是由于表现出一定的毒性,限制了该系统在斑马鱼中的应用。接下来,通过基因工程改造,科学家优化出了更加适用于斑马鱼的光控系统,即TAEL(TA4-EL222)系统(Reade,A.etal.,2017)。C120-EL222系统从哺乳动物细胞到斑马鱼的跨越,扩展了该光控系统的应用范围,同时也为鱼类的研究提供了一个有力的工具。基于此,申请人在Sf9昆虫细胞中建立了一个以VP-EL222为基础的光控基因表达系统,将C120-EL222光控系统的元件和荧光蛋白报告基因巧妙地整合到一个昆虫细胞表达载体上,从而使光控系统效能的测试更加快速而稳定,使昆虫细胞中外源蛋白表达的调控更加灵活。我们首次在昆虫细胞中成功实现了C120-EL222系统的光控表达,扩展了该光控系统适用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种应用于昆虫细胞的光控表达载体pMIB-C120-MCS-GFP-EL222,所述载体的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示,该载体巧妙地整合了C120-EL222光控系统的调控元件和荧光蛋白报告基因,利用opIE1组成性启动子调控GFP报告基因串联EL222转录因子的表达;利用光控调节启动子C120DNA序列调控外源基因的表达,提高了这种光控系统的灵活性和易操作性。同时,该载体还保留了杀稻瘟菌素抗性基因,可用于筛选光控表达的稳定细胞系,新引入了GFP报告基因,便于实时监控载体的转染效率,以及通过基于绿色荧光标记的流式细胞仪快速高效分选光控表达的稳定细胞系。本专利技术的另一个目的在于提供了一种昆虫细胞的光控表达载体的应用,将外源蛋白插入pMIB-C120-MCS-GFP-EL222中后,转染至昆虫细胞Sf9,可实现功能蛋白的光控表达。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案是:一种带有外源蛋白的昆虫细胞的光控表达载体的制备方法,包括:1)外源基因通过EcoR1和Xba1酶切位点置换pC120-Luc质粒中的Luc基因,得到pC120-外源基因质粒;2)以pC120-外源基因质粒为模板,扩增C120-外源基因片段,插入pMIB/V5-his载体的BspH1和Age1酶切位点中,得到pMIB-C120-外源基因质粒;3)人工合成SEQIDNO.2所示核苷酸片段,克隆置于psimple-T载体中,得到psimple-T/PFT2AN载体,通过psimple-T/PFT2AN中的Nhe1酶切位点引入荧光蛋白报告基因,再通过psimple-T/PFT2AN中的BsiwI酶切位点引入EL222基因,得到psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒;4)将psimple-T/荧光蛋白-EL222质粒中的荧光蛋白-EL222片段,通过PvuII和BglII酶切位点插入到pMIB-C120-外源基因质粒中,得到pMIB-C120-外源基因-荧光蛋白-EL222质粒载体;所述的pMIB/V5-his载体为pMIB/V5-hisA或pMIB/V5-hisB或pMIB/V5-hisC。本领域技术人员可根据实际情况,根据上述的方法,制备表达不同外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体;或是直接将外源蛋白插入光控表达载体pMIB-C120-MCS-GFP-EL222中(C120后的MCS携带多种酶切位点,供外源基因的插入)中,来制备携带外源蛋白的昆虫细胞光控表达载体。一种昆虫细胞的光控表达载体的应用,包括利用该光控表达载体构建昆虫细胞的光控表达平台,或是利用该载体控制蛋白的表达。以上所述的方案中,具体的,是将pMIB-C120-外源基因-GFP-EL222质粒载体转染至昆虫细胞中,然后按照需要进行蓝光照射或是黑暗处理,来控制外源蛋白的表达。与现有技术相比,本专利技术具有以下优点:1.将C120-EL222光控系统的元件巧妙地整合到一个昆虫细胞表达载体,提供了一种质粒构建的范式。2首次在昆虫细胞中实现了该C120-EL222光控系统的光控表达应用,扩展了该光控系统新的适用范围。3.将原C120-EL222光控系统的元件由多质粒携载简化为单质粒携载,极大提高了转染后效应细胞的阳性比率,也使得该光控系统的测试更加快速而稳定。本光控系统工作的测试指标为:蓝光诱导后,在有绿色荧光蛋白GFP表达的Sf9细胞中,可通过检测红色荧光蛋白mCherry的表达来反映光控元件的工作效能。4.在光控质粒中引入组成型表达GFP报告基因,便于通过绿色荧光标签的流式细胞仪进行阳性细胞筛选,大大提高了筛选稳定光控细胞系的效率。附图说明图1昆虫细胞表达载体pMIB/V5-His图谱。图2为基于C120-EL222的光控表达系统原理图。图3为昆虫细胞光控表达载体pMIB-C120-mCherry本文档来自技高网
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一种昆虫细胞的光控表达载体及应用

【技术保护点】
一种应用于昆虫细胞的光控表达载体,所述载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种应用于昆虫细胞的光控表达载体,所述载体的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.一种带有外源蛋白的昆虫细胞的光控表达载体的制备方法,包括:1)外源基因通过EcoR1和Xba1酶切位点置换pC120-Luc质粒中的Luc基因,得到pC120-外源基因质粒;2)以pC120-外源基因质粒为模板,扩增C120-外源基因片段,插入pMIB/V5-his载体的BspH1和Age1酶切位点中,得到pMIB-C120-外源基因质粒;3)人工合成SEQIDNO.2所示核苷酸片段,克隆置于psimple-T载体中,得到psimple-T/PFT2AN...

【专利技术属性】
技术研发人员:吴阳徐富强何晓斌蔡泽蕲蒋良玉梅婷尚敏
申请(专利权)人:中国科学院武汉物理与数学研究所
类型:发明
国别省市:湖北,42

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