一种基于CRISPR系统的基因组编辑方法及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR系统的基因组编辑方法，属于基因编辑技术领域，本发明专利技术所述的方法利用内含子来表达CRISPR基因组编辑系统中的引导RNA分子，其原理是将一个或多个tRNA‑gRNA或crRNA串联单元置于编码基因的内含子中，并且可以将该内含子与Cas9或Cpf1形成融合基因后用一个启动子驱动。所述方法巧妙利用了细胞内源的mRNA剪接系统和tRNA加工系统，不需要添加其他元件，不仅安全性更高，而且可以更加简单；而利用一个启动子实现多个引导RNA与Cas9或Cpf1的同步表达，简化了已有的CRISPR编辑系统，同时提高了CRISPR编辑系统的同时编辑多个靶位点的效率和能力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR系统的基因组编辑方法及其应用
本专利技术属于基因组编辑
，具体涉及一种基于CRISPR系统的基因组编辑方法。
技术介绍
基因组编辑技术是利用人工设计和改造的核酸酶对基因组进行精确地定点修饰，包括对基因组进行靶向基因敲入(Knock-in)、基因功能敲除(Knock-out)以及有目的地片段替换。CRISPR/Cas9(Clustered,RegularlyInterspaced,ShortPalindromicRepeat/CRISPRAssociatedProtein9System)系统的发现和应用为生物学的基础理论研究和转化应用提供了简单、强大的基因组编辑平台，因此迅速成为遗传操作的主流工具，并广泛地用于基础研究、疾病治疗、作物遗传改良等不同的领域。CRISPR/Cas是细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统，能特异地降解入侵噬菌体或外源质粒的DNA，其中CRISPR是“成簇和规律间隔的短回文序列”的简称，而Cas是指与CRISPRRNA结合的蛋白。在2012年，Jinek等解开了化脓链球菌Streptococcuspyogenes的II型CRISPR/Cas9系统作用机制，并证明Cas9核酸酶(本文专指Strepcococcuspyogenes的Cas9)可以在一个人造的小RNA分子(称为gRNA,即GuideRNA)的引导下去靶向切割DNA双链。利用Cas9/gRNA标靶特定的DNA位点需要满足2个条件：(1)gRNA的5’端20nt(Nucleotides)的引导序列(称为Spacer或Guidesequence)与靶DNA位点的序列(称为Protospacer)互补匹配；(2)靶位点必需存在PAM(Protospacer-adjacentmotif)，其中使用最广的化脓链球菌Cas9的PAM序列为5’-NGG-3’。在使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑时，一般用PolII(RNAPolymeraseII，II型RNA聚合酶)启动子表达含核定位信号的Cas9，用PolIII(RNAPolymeraseIII)启动子表达gRNA，Cas9/gRNA复合体识别靶DNA后在PAM前面的第3个和第4个脱氧核酸之间切割DNA双链，形成DSB(DoublestrandedDNAbreak，双链DNA断裂)。除CRISPR/Cas9外，CRISPR/Cpf1也被开发为一个DNA编辑的平台。2015年美国麻省理工大学的ZhangFeng实验室首先发现了II类CRISPR系统第5亚家族的成员Cpf1核酸内切酶，并证实了来自氨基酸球菌属Acidaminococcus、毛螺科菌属Lachnospiraceae和弗朗西斯氏菌属Franisellanovicida的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1三个高度同源蛋白都具有RNA引导的DNA内切酶的活性，而且AsCpf1和LbCpf1用于动物的基因组编辑效率接近原来的CRISPR/Cas9系统。与Cas9不同，Cpf1通过CRISPRRNA(crRNA)的引导去靶向切割DNA序列，其中靶序列位于crRNA的3’-端。与Cas9比较，Cpf1的引导RNA更短，但引导序列(即DNA靶位点)更长(～24nt)；特异性高、容易实现多位点编辑，基因组编辑的范围大；更易于引入的indel，从而提高knock-out的效率。基于CRISPR的基因组编辑载体都需要两个组分，一是CRISPR系统的核酸酶，比如常用的Cas9和Cpf1；二是引导RNA，如gRNA(用于引导Cas9)和crRNA(用于引导Cpf1)。在一般的载体系统中，Cas9和Cpf1可以用常见的RNA聚合酶II型的启动子表达(PolII)；而gRNA和crRNA用PolIII型的启动子表达。在已有的CRISPR技术中，引导RNA的表达采用PolIII启动子，PolIII启动子数量有限而且表达引导RNA的第一个碱基是固定的；PolIII启动子为组成型表达的，无法构建诱导表达或时空特异表达的基因组编辑技术；Cas9和gRNA用不同的启动子表达，无法同步控制两者的表达量。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR系统利用内含子表达gRNA和Cas9核酸酶的高效率的多重基因编辑方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种基于CRISPR系统CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，包括以下步骤：1)将1个或多个重复的tRNA-gRNA串联单元置于编码基因的内含子中获得inPTG内含子；2)将获得的inPTG内含子与含Cas9核酸酶基因的外显子融合成一个inPTG-Cas9基因；3)利用单个启动子来驱动inPTG-Cas9融合基因的表达，获得表达载体；4)将所述含inPTG-Cas9融合基因表达元件的载体导入受体细胞进行转录表达，获得Cas9核酸酶和多个gRNA；5)所述gRNA与Cas9核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。优选的，步骤3)中所述启动子为PolII型启动子。优选的，所述PolII型启动子为UBI10启动子、PR5启动子或PR1启动子。优选的，步骤4)中所述载体为pRGEB33载体，所述pRGEB33载体的内含子的序列如SEQIDNO.7所示.优选的，步骤4)中所述载体为pRGEB34载体，所述pRGEB34载体的内含子的序列如SEQIDNO.8所示。优选的，所述内含子中插入BsaⅠ酶切位点用于PTG片段的克隆。本专利技术还提供了一种基于CRISPR系统CRISPR/Cpf1的基因组编辑方法，包括以下步骤：1)将一个或多个重复的tRNA-crRNA串联单元(polycistronictRNA-crRNA，简称PTC)置于编码基因的内含子中获得intron(PTC)内含子；2)将获得的intron(PTC)内含子与含Cpf1核酸酶基因编码区的外显子融合形成一个intron(PTC)-Cpf1融合基因；3)在所述intron(PTC)-Cpf1融合基因序列前添加启动子获得启动子-intron(PTC)-Cpf1融合基因序列；4)将所述启动子-intron(PTC)-Cpf1融合基因置于载体中，导入受体细胞进行转录表达，获得Cpf1核酸酶和多个crRNA；5)所述crRNA与Cpf1核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。优选的，所述转录表达Cpf1的过程中，利用剪接复合体剪切所述intron(PTC)-Cpf1融合基因中的包含PTC的内含子，然后利用tRNA加工系统切割其中的tRNA元件，释放多个crRNA。优选的，步骤1)中所述多个重复的tRNA-crRNA串联单元可替换为多个crRNA串联单元。优选的，所述替换后利用表达的Cpf1蛋白切割crRNA串联单元，释放多个crRNA。优选的，所述编辑包括为基因敲除、靶向基因激活/抑制、单碱基替换。本专利技术的有益效果：本专利技术所述的方法将多个tRNA-gRNA/crRNA串联单元置于编码基因的内含子中，并且将inPTG与Cas9/Cpf1形成融合基因，巧妙利用了细胞内源的mRNA剪接系统和tRNA加工系统，不需要添加其他元件，安全性更高；利用一个启动子实现多个gRNA/crRNA与Cas9/Cpf1的同步表达，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPR系统CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，包括以下步骤：1)将1个或多个重复的tRNA‑gRNA串联单元置于编码基因的内含子中获得inPTG内含子；2)将获得的inPTG内含子与含Cas9核酸酶基因的外显子融合成一个inPTG‑Cas9基因；3)利用单个启动子来驱动inPTG‑Cas9融合基因的表达，获得表达载体；4)将所述含inPTG‑Cas9融合基因表达元件的载体导入受体细胞进行转录表达，获得Cas9核酸酶和多个gRNA；5)所述gRNA与Cas9核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR系统CRISPR/Cas9的基因组编辑方法，包括以下步骤：1)将1个或多个重复的tRNA-gRNA串联单元置于编码基因的内含子中获得inPTG内含子；2)将获得的inPTG内含子与含Cas9核酸酶基因的外显子融合成一个inPTG-Cas9基因；3)利用单个启动子来驱动inPTG-Cas9融合基因的表达，获得表达载体；4)将所述含inPTG-Cas9融合基因表达元件的载体导入受体细胞进行转录表达，获得Cas9核酸酶和多个gRNA；5)所述gRNA与Cas9核酸酶共同作用编辑受体细胞基因组序列。2.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)中所述启动子为PolII型启动子。3.根据权利要求2所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述PolII型启动子为UBI10启动子、PR5启动子或PR1启动子。4.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述步骤4)中载体为pRGEB33载体，所述pRGEB33载体的内含子的序列如SEQIDNO.7所示。5.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述步骤4)中载体为pRGEB34载体，所述pRGEB34载体的内含子的序列如SEQIDNO.8所示。6.根据权利要求4或5所述的基因组编辑方法，其特征在于，所述内含子中插入BsaI酶切位点用于PTG片段的克隆。7.一种基于CRISPR系统CRISPR/Cpf1的基因组编辑方...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢卡斌，陈凯园，丁丹，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42