一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用技术

技术编号:17770310 阅读:49 留言:0更新日期:2018-04-21 23:03
本发明专利技术涉及遗传工程技术领域,具体而言,涉及一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。所述构建方法包括:敲除Bacillus subtilis strain 168菌株的纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS,得到所述不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。所述构建方法构建得到的突变菌株可产生果胶酶和半纤维酶等多种脱胶酶,能直接分解苎麻韧皮中的胶质成分,可将该菌株应用于苎麻微生物脱胶,具有完全不损伤苎麻纤维、对人畜安全的优点,有利于保护生态环境。

【技术实现步骤摘要】
一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及遗传工程
,具体而言,涉及一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
苎麻(Boehmerianivea)是荨麻科苎麻属作物,其韧皮的单纤维长、强度大、吸湿和散湿迅速、热传导性能优良,是纺织行业的重要原料。我国是苎麻的主要产地,产量约占全世界的90%以上,具有较大的经济效益和国际影响力。然而,苎麻原麻中含有30%左右由果胶和半纤维素组成的键合型非纤维素物质(俗称“胶质”),这些胶质的存在会影响苎麻纤维的质量,不能直接用于纺织。脱胶是苎麻纤维用于纺织前的必经关键步骤,目前苎麻的脱胶方法有传统沤麻法、化学脱胶法和生物脱胶法。传统沤麻法污染大、耗时长,已不适应于工业化的生产。工业上常用的化学脱胶法高耗能、高污染,废水中COD含量高,且该方法中的酸和碱对苎麻纤维的损坏较大,严重制约了苎麻纤维加工行业的发展,高效环保节能的生物脱胶方式则改变了这一现状。菌种是促进苎麻生物脱胶产业化的关键制约因素,长期以来,为了获得能适用于工厂化生产的苎麻生物脱胶菌株,科研工作者在苎麻脱胶过程中筛选了多株具有脱胶功能的菌种。目前,从自然界中筛选获得的纯种菌株多达数十株,其中芽孢杆菌属所占比例高达60%以上。在所鉴定的芽孢杆菌中,除了未鉴定到种的菌株外,大部分菌株属于枯草芽孢杆菌。如刘自镕等在公开号CN1157475C,公开日2004年7月14日的专利技术专利中采用枯草芽孢杆菌进行苎麻脱胶;潘祖楷等在公开号CN1055118C,公开日2000年8月2日的专利技术专利中采用枯草芽孢杆菌A-5进行苎麻脱胶;李明凤等在公开号CN1055118C,公开日2000年8月2日的专利技术专利中采用枯草芽孢杆菌CGMCCNo.0213进行苎麻脱胶。上述专利中均是利用芽孢杆菌发酵后的上清液开展苎麻酶法脱胶。何连芳等在公开号CN101575739B,公开日2011年12月28日的专利技术专利中采用枯草芽孢杆菌进行苎麻微生物固态脱胶,1~4天内可完成脱胶。以上现有菌株都属于野生型微生物菌种,没有从分子生物学的角度确证所用菌种是否产外泌型的纤维素酶,脱胶过程中对苎麻纤维是否有损伤,且未评估所述菌种对生态环境的影响。Bacillussubtilisstrain168为枯草芽孢杆菌的模式菌种(modelorgnaism),被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主,其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别,是食品级益生菌。该菌种可分泌果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖水解酶等多种适用于果胶和半纤维素降解的胞外酶,具有苎麻生物脱胶的潜能。现有公开专利中的苎麻生物脱胶菌株都属于野生型微生物菌种,没有从分子生物学的角度确证所用菌种是否产外泌型的纤维素酶,脱胶过程中对苎麻纤维是否有损伤,且未评估所述菌种对生态环境的影响。B.subtilis168也能够表达纤维素酶,这意味着不能直接将B.subtilis168菌株用于苎麻生物脱胶,因此有必要通过生物工程手段对该菌进行改造以拓展其应用。有鉴于此,特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术公开了一种不产纤维素酶的枯草芽孢杆菌及其在苎麻微生物脱胶中的应用,属于遗传工程领域。本专利技术以生理生化信息清晰、遗传背景清楚及已完成全基因组测序的食品级微生物枯草芽孢杆菌168菌株作为出发菌株,通过同源重组双交换的方法敲除纤维素酶基因(eglS),使纤维素酶不再表达,阻断了该菌株中降解纤维素的生物途径,为利用基因工程手段改造其他脱胶菌株奠定了基础。所述突变菌株可产生果胶酶和半纤维酶等多种脱胶酶,能直接分解苎麻韧皮中的胶质成分,可将该菌株应用于苎麻微生物脱胶,具有完全不损伤苎麻纤维、对人畜安全的优点,有利于保护生态环境。为了实现本专利技术的上述目的,特采用以下技术方案:本专利技术涉及一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,包括:敲除Bacillussubtilisstrain168菌株的纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS,得到所述不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。B.subtilis168基因组中含纤维素酶基因eglS,本专利技术经生物信息学分析,表明该基因编码的纤维素酶EglS(EC3.2.1.4)为胞外分泌的生物酶。因此,这意味着不能直接将B.subtilis168菌株用于苎麻生物脱胶,需对该菌株中的eglS基因进行阻断后再应用于苎麻脱胶。本专利技术通过同源重组双交换的技术敲除纤维素酶Endoglucanase编码基因(eglS),阻断B.subtilis168菌株降解纤维素的途径,所获得的工程菌株ΔeglS可用于苎麻生物脱胶,且对环境安全无污染,可实现苎麻脱胶的清洁生产。本专利技术还涉及所述方法构建得到的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。根据本专利技术的一方面,本专利技术还涉及所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌在苎麻生物脱胶中的应用。与现有技术相比,本专利技术的有益效果为:1).所述工程菌株枯草芽孢杆菌ΔeglS不产纤维素酶Endoglucanase,生物脱胶过程中完全不会损伤苎麻纤维。2).所述工程菌株枯草芽孢杆菌ΔeglS为食品级微生物,安全无公害,不会造成环境污染。3).本专利技术所述工程菌株的构建方法可为其他苎麻脱胶高效工程菌株的构建奠定理论基础和提供实践参考。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术所采用的同源重组双交换技术原理示意图;图2为本专利技术一个实施例中,同源臂的琼脂糖凝胶电泳检测图;图3为本专利技术一个实施例中,添加ΔeglS菌株与未添加该菌株的苎麻生物脱胶比较图。具体实施方式本专利技术涉及一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,包括:敲除Bacillussubtilisstrain168菌株的纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS,得到所述不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。优选的,如上所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,所述敲除的方法为同源重组法。优选的,如上所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,所述方法具体包括:构建含有抗生素抗性基因的同源臂并转化入感受态Bacillussubtilisstrain168细胞中,通过同源重组将所述抗生素抗性基因插入纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS的阅读框中,得到具有抗生素抗性的工程菌株枯草芽孢杆菌ΔeglS。优选的,如上所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,所述抗生素抗性基因为卡那抗性aph基因。优选的,如上所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,所述含有抗生素抗性基因的同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的,如上所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,所述感受态Bacillussubtilisstrain168细胞的制备方法为CaCl2法;优选的,所述感受态Bacillussubtilisstrain168细胞的制备方法包括:将Bacillussubtilisstrain168菌种依次于GMI培养基和GMI本文档来自技高网
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一种不产纤维素酶枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

【技术保护点】
不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,包括:敲除Bacillus subtilis strain 168菌株的纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS,得到所述不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。

【技术特征摘要】
1.不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,包括:敲除Bacillussubtilisstrain168菌株的纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS,得到所述不产纤维素酶枯草芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,所述敲除的方法为同源重组法。3.权利要求2所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,所述方法具体包括:构建含有抗生素抗性基因的同源臂并转化入感受态Bacillussubtilisstrain168细胞中,通过同源重组将所述抗生素抗性基因插入纤维素酶Endoglucanase编码基因eglS的阅读框中,得到具有抗生素抗性的工程菌株枯草芽孢杆菌ΔeglS。4.根据权利要求3所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,所述抗生素抗性基因为卡那抗性aph基因。5.根据权利要求4所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,所述含有抗生素抗性基因的同源臂的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。6.根据权利要求3所述的不产纤维素酶枯草芽孢杆菌的构建方法,其特征在于,所述感受态Bacillussubtilisstrain168细胞的制备方法为CaCl2法;优选的,所述感受态Bacillussubtilisstrain168细胞的制备方法包括:将Bacillussubtilisstrain168菌种依次于GMI培养基和GMII培养基中培养即得;所述GMI培养基的成分包括:磷酸氢二钾13g/L~13.8g/L,磷酸二氢钾5.3g/L~6.1g/L,硫酸铵1.7g/L~2.1g/L,柠檬酸钠0.8g/L~1.2g/L,七水硫酸镁0.15g/L~0.25g/L,葡萄糖0.4g/L~0.6g/L,酪蛋白0.15g/L~0.25g/L,酵母提...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨琦彭源德段盛文成莉凤冯湘沅刘志远郑科
申请(专利权)人:中国农业科学院麻类研究所
类型:发明
国别省市:湖南,43

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