CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法技术方案

本发明专利技术提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受，普通技术人员获得的菌株阳性率低，阳性菌株挑选费时费力的技术问题。CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含

【技术实现步骤摘要】
CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法
本专利技术涉及分子生物学和生物
，特别涉及CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法。
技术介绍
CRIPSR/Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术，广泛应用于各类体内和体外体系的遗传学改造、转基因模式动物的构建，甚至基因治疗领域。在利用CRIPSR/Cas9系统进行基因编辑操作时，需要选定一种sgRNA的供给形式。以对哺乳动物细胞的基因编辑为例，可使用质粒或病毒为载体表达sgRNA，也可以在体外将sgRNA生产纯化出来后，直接转染进细胞实行功能。当然，以何种形式导入sgRNA取决于实验需要以及细胞本身的特性，但在通常情况下直接将sgRNA构建于表达载体之上更为经济和便捷。特别是可同时表达优化的Cas9蛋白及sgRNA的All-in-one载体的出现使得研究者们能够更加轻松的利用单个质粒实现基于CRIPSR/Cas9系统的基因编辑[CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.MultiplexGenomeEngineeringusingCRISPR/Cas-systems.Science339,819-823(2013).]。在sgRNA骨架载体的构建过程中，最为重要的一步是质粒的线性化。几乎所有的sgRNA骨架载体都会利用识别位点和切割位点不一致的IIS型内切酶，使得sgRNA寡核苷酸单链退火配对之后能够无缝插入。然而常用的IIS型内切酶如BsmBI等酶切效果并不充分。为解决这一问题，一些载体，例如pX330，其在使用过程中往往会在两个反向的IIS型内切酶的酶切位点之间加入区分片段，从而可以通过胶回收的方法将线性化的载体和空质粒加以区分。尽管这一手段是有效且必要的，然而在实际操作中假阳性的产生依旧无法避免，尤其在胶回收过程中，对操作要求以及试剂配制要求较高，普通技术人员回收的线性化质粒中参杂了未充分酶切的载体，在与退火形成的具有粘性末端的sgRNA短双链DNA片段进行连接后，由于残留的少数空质粒转化效率要远远超过连接产物，因而转化大肠杆菌涂板后长出的大部分克隆都是含有空质粒的假阳性转化子，阳性率很低，往往在10%左右，需要挑较多的单克隆进行菌落PCR鉴定才能得到阳性克隆，费时费力。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受，普通技术人员获得的菌株阳性率低，阳性菌株挑选费时费力的技术问题。其技术方案是这样的，CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述步骤（4）还包括将PCR鉴定阳性的菌分别涂LB抗性板和含5%~10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%~10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表面该菌含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。进一步的，步骤（1）制备线性化的sgRNA空质粒，若已有sgRNA空质粒，则用相应的IIS型内切酶直接对其进行酶切，酶切后胶回收得到线性化的sgRNA空质粒；或者根据已构建入某sgRNA的质粒，设计引物对此质粒进行全质粒PCR，以获取含有IIS型内切酶酶切接头的sgRNA空质粒，随后同样用IIS型内切酶对其进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒。进一步的，所述步骤（2）制备区分片段，根据pK18mobSacB载体图谱和序列设计一对含有上述IIS型内切酶酶切位点接头的引物，该引物的扩增子应包含sacB基因的ORF及其启动子和终止子，用该引物对pK18mobSacB载体进行PCR，获得目的片段，胶回收PCR产物，用IIS型内切酶对其进行酶切，柱纯化后得到区分片段。进一步的，步骤（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段混匀，加入T4连接酶以及T4连接酶Buffer，置于16°金属浴过夜连接。进一步的，步骤（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的连接产物转化大肠杆菌，涂抗性平板，培养12~20小时至平板上形成单克隆，挑单克隆并用步骤（2）中所述引物进行菌落PCR鉴定，PCR鉴定阳性的菌落转入摇瓶培养过夜，随后进行质粒抽提，用所述IIS型内切酶酶切质粒，将酶切鉴定正确的克隆摇过夜，稀释后分别涂LB抗性板和含5%-10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%-10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表明菌中含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。本专利技术的构建方法将长达两千多bp的sacB基因相关序列构建在传统sgRNA载体的两个IIS型内切酶识别位点之中，一者可以通过电泳将空质粒与线性化质粒分开；再者，蔗糖致死基因sacB可使大肠杆菌将环境中的蔗糖分解为葡萄糖和果糖，并催化后者形成果聚糖，导致菌死亡，即使回收产物之中依然残留的空质粒，其大肠杆菌转化子也无法在含蔗糖的抗性板上形成单菌落，因为平板上长出来的大多是sacB基因已被IIS型内切酶切除、5%-10%蔗糖无法致死、构入了sgRNA片段的克隆，经实验表明，采用本方法构建sgRNA骨架载体的阳性率可以达到95%以上。附图说明图1为应用例1中pX330-p53为出发载体制备线性化的pX330空质粒PCR引物设计示意图。图2为应用例1的步骤（3）的制备重组sgRNA骨架载体的示意图。图3为应用例1的步骤（4）的bbsI酶切鉴定的电泳图，Marker：DL10000Marker；Lane1:bbsI酶切后质粒约8500，酶切下来的sacB基因相关片段约2500。图4为应用例1的pX330-sacB质粒图谱。具体实施方式实施例1CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，目的是为了sgRNA短片段能够无缝插入到启动子与scaffold之间；若已有sgRNA空质粒，直接用相应的IIS型内切酶酶切处理即可；酶切完成后胶回收获得线性化的sgRNA空质粒。若无sgRNA空质粒，只有已构建入某sgRNA的质粒，则设计引物对此质粒进行全质粒PCR，以消除质粒上本文档来自技高网...

【技术保护点】
CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含

【技术特征摘要】
1.CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤：（1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒；（2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段；（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体；（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定；其特征在于：所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述步骤（4）还包括将PCR鉴定阳性的菌分别涂LB抗性板和含5%~10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%~10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表面该菌含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。2.根据权利要求1所述的CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）制备线性化的sgRNA空质粒，若已有sgRNA空质粒，则用相应的IIS型内切酶直接对其进行酶切，酶切后胶回收得到线性化的sgRNA空质粒；或者根据已构建入某sgRNA的质粒，设计引物对此质粒进行全质粒PCR，以获取含有IIS型内切酶酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴晓峰，高雄，孙曼曼，白仲虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32