本发明专利技术涉及一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，能在表达microRNA(以hsa‑miR‑301a为例)模拟物或阻遏物的同时表达CD19‑CAR的基于pFIV载体的pFIV‑microRNA(miR‑301a)‑CD19CAR系统；通过引入microRNA模拟物或阻遏物到携带有CAR序列的载体中，实现同时表达microRNA基因调控功能和肿瘤特异性抗原CD19的CAR，从而实现双重对T细胞的基因编辑和修饰功能，从而制备出新一代的具有更高安全性和有效性的CAR，更加适用于临床研究。
【技术实现步骤摘要】
一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法
本专利技术涉及pFIV-miR-301a-CD19CAR系统构建技术，特别是涉及一种共同表达hsa-miR-301a模拟物或阻遏物，和表达CD19-CAR的基于pFIV载体的pFIV-miR-301a-CD19-CAR系统构建方法。
技术介绍
嵌合抗原受体技术(ChimericAntigenReceptor，CAR)是利用基因编辑技术，使T细胞表达肿瘤特异性嵌合抗原受体，以非主要组织相容性复合体(MHC)限制的方式结合肿瘤抗原，对肿瘤起到杀伤作用。CAR的结构主要包括四部分：细胞外的抗体单链可变区(可特异性结合肿瘤相关抗原)，胞外铰链区，跨膜结合区和活化T细胞的胞内信号区。第I代CAR介导的T细胞激活是通过CD3ζ链或FcRγ的酪氨酸激活基序完成，但是第I代CAR无法完全激活T细胞，也难以维持T细胞的持久增殖及细胞杀伤作用。第II代CAR增加了共刺激结构分子如CD28或CD137(4-1BB)，引入CD28信号肽可以引起T细胞的增殖，提高IL-2和IFN-γ的水平，而引入CD137信号肽使得T细胞的扩增及杀伤肿瘤活性更持久。第III代CAR除了CD3ζ和CD28两种信号分子，还增加了多种不同的信号分子结构来调节T细胞增殖和杀伤毒性等，如经典的CD28和4-1BB联合使用，以及包含共刺激结构分子OX40(TNFRSF4)和ICOS的联合使用，都可以增加体内肿瘤细胞消退。迄今为止，引入共刺激分子信号的第二代和第三代CAR，提高了T细胞的细胞毒性、体内增殖活性、持续存活时间和增加细胞因子释放等功能。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率(Completeremission，CR)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。虽然CAR-T细胞免疫疗法在多种恶性肿瘤的治疗中取得了很好的疗效，但在治愈肿瘤患者的同时也带来诸多不良反应，如CAR-T细胞在清除肿瘤的同时也会攻击正常组织，治疗同时会产生大量细胞因子导致患者多器官功能衰竭等，临床已有致死病例的报道。目前，CAR-T细胞免疫治疗还处于发展阶段，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤的治疗中还有很大的发展空间，对CAR结构进行优化改进，在提升CAR-T细胞抗肿瘤能力的同时减少其不良反应，将为CAR-T细胞免疫治疗的大规模临床应用提供新的思路和方向。miRNA是真核生物中具有调节功能的非编码RNA，其长度约为21-25个碱基。成熟的miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶分子mRNA3’端非编码区(3’-UTR)上的特异性序列，导致mRNA降解或者翻译阻遏，从而在翻译水平实现对基因表达的调控，并参与调控多种疾病的发生、发展过程。miRNA在固有免疫和适应性免疫细胞中可通过特定的表达谱调节细胞的分化和功能，从而参与机体促肿瘤和抗肿瘤免疫的调节，如参与T细胞调节的miR-17-92家族，miR-155和miR-181a等，参与巨噬细胞调节的miR-125b，miR-146和miR-155等，以及与损伤分子模式相关的miR-34c和miR-214。因此，将miRNA表达调控和CAR的功能联系在一起，有如下优势：(1)与传统的T细胞共刺激分子活性结构域相比，miRNA分子小(只有21-25个碱基)，miRNA和CAR的整合不会导致因慢病毒质粒过大而产生的CAR表达减低及其脱靶效应；(2)利用多个miRNA可以靶向多个T细胞激活或抑制性转录因子或受体，设计不同miRNA的组合可以最大限度激活T细胞杀伤肿瘤功能；(3)CAR结构中引入microRNA功能可以反向调控细胞因子风暴，对设计合成具有更安全的、有效的新一代整合miRNA的CAR，将有助于我们设计更有效、安全的新一代CAR技术，制备标准化的CAR-T细胞，为临床T细胞免疫治疗提供新的思路和策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，能在表达microRNA(以hsa-miR-301a为例)模拟物或阻遏物的同时表达CD19-CAR的基于pFIV载体的pFIV-microRNA(miR-301a)-CD19CAR系统；通过引入microRNA模拟物或阻遏物到携带有CAR序列的载体中，实现同时表达microRNA基因调控功能和肿瘤特异性抗原CD19的CAR，从而实现双重对T细胞的基因编辑和修饰功能，从而制备出新一代的具有更高安全性和有效性的CAR，更加适用于临床研究。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：(1)查找miRBase数据中hsa-miR-301a(AccessionID：MIMAT0000688)的序列，通过优化设计并合成hsa-miR-301a的模拟物和阻遏物；构建含有microRNA(以hsa-miR-301a为例)模拟物(pre-miR-301a)和阻遏物(sponge-miR-301a)的载体，并由H1启动子驱动。其中pre-miR-301a促进hsa-miR-301a表达升高，sponge-miR-301a抑制has-miR-301a表达，其基因序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2(2)CAR(以CD19-CAR为例)由EF1α驱动并包括：CD19的单链抗体可变区(singlechainvariablefragment,scFv)基因片段序列，CD8来源的连接和穿膜片段序列，传递信号的效应分子CD3ζ序列和胞内信号分子CD28和4-1BB片段序列组成。(3)根据(1)和(2)的序列，采用合成、酶切、连接和转化的方法，分别将hsa-miR-301a(模拟物或阻遏物)和CD19-CAR结构序列连接到含有H1和EF1α的第三代FIV载体上(命名为：pFIV-miR-301a-CD19CAR)，(4)将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中进行大量扩增并提取质粒。采用质粒载体引物进行PCR和测序验证连接序列的正确性。其中miR-301a模拟物或阻遏物测序引物序列为：5’-TGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’；CD19-CAR测序引物为：5’-ATTTATTGTATCTGTGGGAGCCTC-3’(5)共转染质粒pFIV-miR-301a-CD19CAR和FIV慢病毒包装质粒(pFIV-34N和pVSV-G质粒)于293T细胞，收集293T细胞上清，并制备慢病毒颗粒，感染Jurka本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建含有microRNA(以hsa‑miR‑301a为例)模拟物(pre‑miR‑301a)和阻遏物(sponge‑miR‑301a)的载体，并由H1启动子驱动。构建含有CAR(以CD19‑CAR为例)由EF1α驱动并包括：CD19的单链抗体可变区(single chain variable fragment,scFv)基因片段序列，CD8来源的连接和穿膜片段序列，传递信号的效应分子CD3ζ序列和胞内信号分子CD28和4‑1BB片段序列组成；(2)采用合成、酶切、连接和转化的方法，分别将hsa‑miR‑301a(模拟物或阻遏物)和CD19‑CAR结构序列连接到含有H1和EF1α的第三代FIV载体上(名称为：pFIV‑miR‑301a‑CD19CAR)，将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中进行大量扩增并提取质粒；(3)共转染质粒pFIV‑miR‑301a‑CD19CAR和FIV慢病毒包装质粒(pFIV‑34N和pVSV‑G质粒)于293T细胞，收集293T细胞上清，并制备慢病毒颗粒，感染Jurkat细胞。采用荧光定量PCR检测miR‑301a表达，流式细胞技术检测myc‑tag标签来显示CD19‑CAR在细胞膜的表达水平。...
【技术特征摘要】
1.一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建含有microRNA(以hsa-miR-301a为例)模拟物(pre-miR-301a)和阻遏物(sponge-miR-301a)的载体，并由H1启动子驱动。构建含有CAR(以CD19-CAR为例)由EF1α驱动并包括：CD19的单链抗体可变区(singlechainvariablefragment,scFv)基因片段序列，CD8来源的连接和穿膜片段序列，传递信号的效应分子CD3ζ序列和胞内信号分子CD28和4-1BB片段序列组成；(2)采用合成、酶切、连接和转化的方法，分别将hsa-miR-301a(模拟物或阻遏物)和CD19-CAR结构序列连接到含有H1和EF1α的第三代FIV载体上(名称为：pFIV-miR-301a-CD19CAR)，将连接...
【专利技术属性】
技术研发人员：马晓冬，刘明，黄行许，
申请(专利权)人：马晓冬，
类型：发明
国别省市：广东,44
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