一种零背景的平末端克隆载体pRI857及其构建方法和应用技术

技术编号:17770303 阅读:75 留言:0更新日期:2018-04-21 23:02
本发明专利技术公开了一种零背景的平末端克隆载体pRI857构建及其在基因克隆和基因文库构建中的应用,属于生物技术领域。所述的质粒pRI857含有Plac启动子,cI857阻遏基因,噬菌体PR启动子,Kan

【技术实现步骤摘要】
一种零背景的平末端克隆载体pRI857及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种零背景的平末端克隆载体pRI857及其构建方法和应用,具体涉及一种用温敏型启动子cI857-PR控制抗性基因KanR的表达以此作为筛选标记的pRI857克隆载体及其在基因克隆和基因文库构建中的应用,属于生物
技术背景随着现代生物技术的快速发展,通过PCR技术扩增目的DNA片段,利用体外重组的方式,将DNA序列插入到克隆载体中,实现目的基因的异源表达,在医学,工业和农业生产上取得了重要的成就,也给生物技术的发展开辟了一条新的道路。同时,由于生物信息学的突飞猛进,二代测序技术的问世,这样,阳性克隆的筛选显得尤为重要,而有效的筛选手段是对DNA序列测定和后续基因功能验证的必须手段。利用LacZ作为筛选标记的蓝白斑筛选系统,通过产生β-半乳糖苷酶将x-gal分解为半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝,有色物质可以使细菌呈蓝色(Langley,K.E.;etal.(1975)."Molecularbasisofbeta-galactosidasealpha-complementation".ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.72(4):1254–1257.);而阳性克隆则由于外源基因的插入,破坏了LacZ的阅读框,使得β-半乳糖苷酶无法正确表达,不能产生蓝色的5-溴-4-靛蓝,故菌落呈白色,通过颜色的差异可以轻易的挑选出正确克隆。然而这种方法有时候会因为有些空载体也显白色,故而也存在限制。温敏型启动子PR、PL启动子来至于λ噬菌体,受cI857基因的严格调控,30℃下阻遏PR启动子转录,随着温度的提高,阻遏蛋白cI857与PR启动子的结合逐渐减弱,PR启动子的转录则不断提高(VillaverdeA,etal.FineregulationofcI857-controlledgeneexpressionincontinuouscultureofrecombinantEscherichiacolibytemperature[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,1993,59(10):3485-3487.)。当温度达到37℃时,阻遏蛋白cI857对PR启动子的抑制能力减弱,使得PR启动子能驱动抗性基因的表达,通过这一技术来进行分子克隆,可以获得100%的阳性克隆。
技术实现思路
针对基因克隆中的实际问题和需求,本专利技术提供了一种零背景的平末端克隆载体pRI857,该零背景平末端快速克隆载体是利用阻遏子cI857和温敏型启动子PR来控制抗生素基因KanR的表达以此作为筛选标记的pRI857克隆载体,可以高效克隆平末端PCR产物和任何具有平末端的DNA片段。本专利技术的技术方案如下:一种重组质粒pBBR1MCS-PR,为利用PCR扩增质粒pCP20中的PR启动子基因替换pBBR1MCS-2质粒中的KanR的启动子序列,形成全长序列为SEQIDNO.15的重组质粒。一种重组质粒pUC-cI857,为利用PCR扩增质粒pCP20中的cI857基因替换pUC19中的LacZa基因,形成全长序列为SEQIDNO.16的重组质粒。一种零背景的平末端克隆载体pRI857,为利用PCR扩增重组质粒pUC-cI857中的Plac-cI857基因和重组质粒pBBR1MCS-PR中的PR-KanR基因替换质粒pKV6中的AmpR和ermB-ermA基因,PR-KanR基因,Plac-cI857基因与质粒pKV6中的dbl-colE1基因顺序连接形成全长序列为SEQIDNO.17的重组质粒,所述的cI857开放阅读框上设计有BfrBI平末端酶切位点。进一步地,本专利技术还提供上述零背景的平末端克隆载体pRI857的构建方法,包括引物设计、基因克隆和载体构建,利用PCR扩增质粒pCP20中的PR启动子序列来替换质粒pBBR1MCS-2中KanR基因的启动子序列,形成重组质粒pBBR1MCS-PR;利用PCR扩增质粒pCP20中的cI857基因替换质粒pUC19中的LazZa基因,形成重组质粒pUC-cI857;通过合成引物PCR扩增质粒pBBR1MCS-PR中的PR-KanR目的片段,质粒pUC-cI857中的Plac-cI857目的片段和质粒pKV6中的dbl-colE1目的片段,最后将PR-KanR、Plac-cI857、dbl-colE1片段进行顺序连接,得到零背景克隆载体pRI857。本专利技术利用温敏性启动子元件cI857-PR控制抗性基因KanR的表达,并在cI857开放阅读框上设计BfrBI酶切位点,以用于克隆任意DNA片段。在37℃的卡那霉素培养基中,当目的DNA片段插入cI857的BfrBI酶切位点后会破坏原有阻遏基因cI857的阅读框,使得PR启动子的抑制被解除,从而KanR基因得以顺利表达,由此可使转化子在30℃的卡那霉素平板上正常生长,而自连产生的空载体,其转化子在30℃培养时会由于KanR基因依然被cI857蛋白抑制,而不能存活在卡那霉素的平板上,导致细胞死亡,从而实现“零背景”的克隆效果。本专利技术的零背景平末端克隆载体pRI857可用于克隆任意PCR产物和平末端DNA序列,并且以KanR基因作为筛选标记时克隆阳性率可以达到100%。此外,该克隆载体也可用于基因组文库的高效构建,同时能有效避免空载体干扰,是后基因组时代高通量基因筛选与功能验证的一种有效工具。附图说明图1为pBBR1MCS-PR载体的酶切验证图,M表示marker,a表示pBBR1MCS-PR载体经HindIII酶切的条带,b表示pBBR1MCS-PR载体经PstI酶切后的条带。图2为构建完成的pBBR1MCS-PR质粒图谱。图3为pUC-cI857载体的酶切验证图,M表示marker,a表示pUC-cI857载体经ScaI酶切的条带,b表示pUC-cI857载体经ScaI和PciI酶切后的条带。图4为构建完成的pUC-cI857质粒图谱。图5为pRI857载体的酶切验证图,M表示marker,a表示pRI857载体经KpnI酶切后的条带,b表示pRI857载体经PstI酶切后的条带。图6为构建完成的pRI857质粒图谱。图7为DH5α/pRI857分别在37℃(a)和30℃(b)培养平板上生长状况。图8为采用pRI857载体用于克隆绿色荧光蛋白基因克隆平板。图9为利用pRI857载体构建基因组文库后经BamHI酶切后的电泳图。具体实施方式为了进一步阐明本专利技术的适用范围,以下集合实施例和附图对本专利技术加以说明,但该载体的应用不局限本专利技术所定范围。本专利技术所述的质粒pCP20,pUC19,pKV6,pBBR1MCS-2,以及大肠杆菌DH5α,DH10Β均由商业购买。实施例一:一种零背景克隆载体pRI857的构建方法1、一种重组质粒pBBR1MCS-PR的构建方法,包括以下步骤:(1)引物设计:人工设计合成特异性引物序列PRFor:5’-ggttagtatgcagccgtcacagtgctcgttctctggcgtc-3’;PRev:5’-gca本文档来自技高网
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一种零背景的平末端克隆载体pRI857及其构建方法和应用

【技术保护点】
一种零背景的平末端克隆载体pRI857,其特征在于,为利用PCR扩增重组质粒pUC‑cI857中的Plac‑cI857基因和重组质粒pBBR1MCS‑PR中的PR‑Kan

【技术特征摘要】
1.一种零背景的平末端克隆载体pRI857,其特征在于,为利用PCR扩增重组质粒pUC-cI857中的Plac-cI857基因和重组质粒pBBR1MCS-PR中的PR-KanR基因替换质粒pKV6中的AmpR和ermB-ermA基因,PR-KanR基因,Plac-cI857基因与质粒pKV6中的dbl-colE1基因顺序连接形成全长序列为SEQIDNO.17的重组质粒;所述的重组质粒pBBR1MCS-PR,为利用PCR扩增质粒pCP20中的PR启动子基因替换pBBR1MCS-2质粒中的KanR的启动子序列,形成全长序列为SEQIDNO.15的重组质粒;所述的重组质粒pUC-cI857,为利用PCR扩增质粒pCP20中的cI857基因替换pUC19中的LacZa基因,形成全长序列为SEQIDNO.16的重组质粒所述的cI857开放阅读框上设计有BfrBI平末端酶切位点。...

【专利技术属性】
技术研发人员:汪洋张开易军苏会娟杨慕晗
申请(专利权)人:南京理工大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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